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磁性高分子微球是最近发展起来的一种新型功能高分子材料,由于其具有良好的磁响应性、粒径小、比表面积大、生物相容性好等优点而广泛地应用于生物技术各个领域。本文采用环氧基化和氨基化修饰的两种磁性高分子微球,作为酶固定化载体,对重组几丁质酶进行固定化研究。本文主要包括以下几方面内容:
采用改进的化学共沉淀法,以氯化亚铁、氯化铁、氢氧化钠为主要原料合成了Fe3O4的磁性微球。Fe3O4磁性微球粒径分布均匀且分散性较好,红外吸收光谱图中的Fe-O特征峰和其表面的-OH振动峰,与Fe3O4晶体结构中Fe-O、-OH标准特征吸收峰吻合。
以Fe3O4磁性微球为核,表面分别接枝3-氨丙基三乙氧基硅烷A3O2(APTES)和甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA),制备了氨基化磁性载体(A-type)和环氧基化磁性载体(P-type),采用扫描电镜、原子粒显微镜及红外吸收光谱图等分析方法进行表征。结果表明:A-type的粒径在100 nm范围内,具有超顺磁性,红外吸收光谱图表明微粒表面成功引入了氨基;P-type的形貌趋近于球形,粒径在100 nm内,红外吸收光谱图表明微粒表面成功了引入了环氧基。
将A-type、P-type用于固定化重组几丁质酶,探讨了重组几丁质酶的最佳固定化条件。结果表明,A-type固定重组几丁质酶的最佳条件:加酶量100 mL/g载体,11%的戊二醛用量为50 mL,固定化时间为5 h。P-type固定重组几丁质酶的最佳条件:加酶量120 mL/g载体,固定化时间为9 h。
通过对P-type、A-type的固定效果及固定化酶的酶学性质研究,结果表明:P-type单位蛋白载量高于A-type,而两者的分离纯化倍数相近。与游离酶相比,固定化重组几丁质酶有更好的贮藏稳定性、热稳定性及酸碱稳定性;固定化重组几丁质酶重复利用7次后,剩余酶活力在44%以上;固定化重组几丁质酶的最适作用pH在6.8~8。