【摘 要】
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黄芪多糖（Astragalus polysacharin,APS）是黄芪最重要的天然有效成分之一,拥有多种生物学功能,包括免疫调节、抗氧化剂、抗肿瘤,抗糖尿病等,已广泛应用于临床。棕色脂肪（Brown adipose tissue,BAT）是哺乳动物产热器官,其功能对初生动物体温维持至关重要。细胞内存在大量长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lnc RNAs）和小RNA（Mi
【基金项目】
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国家自然科学基金（31972559）；
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黄芪多糖（Astragalus polysacharin,APS）是黄芪最重要的天然有效成分之一,拥有多种生物学功能,包括免疫调节、抗氧化剂、抗肿瘤,抗糖尿病等,已广泛应用于临床。棕色脂肪（Brown adipose tissue,BAT）是哺乳动物产热器官,其功能对初生动物体温维持至关重要。细胞内存在大量长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lnc RNAs）和小RNA（Micro RNAs,miRNAs）。研究表明,BAT的分化受lnc RNA与miRNA调控。APS与棕色脂肪细胞分化的关系尚未建立。本试验旨在探究APS对棕色脂肪分化的影响,阐明lnc RNAs与miRNA在此过程中的作用。本试验以C3H10T 1/2细胞为研究对象,在成脂诱导分化培养基中添加0.4 mg/m L的APS,使用油红O染色、细胞免疫荧光技术和Western Blotting分析了APS对其成脂分化能力的影响。通过构建测序文库并测序,筛选了APS对棕色脂细胞分化中mRNAs、lncRNAs和miRNAs表达谱的影响,并对差异m RNAs和差异lnc RNAs的顺式及共表达作用预测的靶基因进行了功能分析。通过双荧光素酶报告实验检测系统分析了miR-6911与其靶基因PR结构域家族的第16个成员（PR domain zinc finger protein 16,PRDM16）之间是否具有靶标关系;转染miR-6911 mimics和inhibitors改变其表达,研究了miR-6911对PRDM16和棕色脂肪分化中关键转录因子的影响。通过q RT-PCR随机分析了m RNA、lnc RNAs和miRNAs的表达水平,验证了测序结果的准确性。研究结果表明:（1）APS促进了C3H10T 1/2细胞棕色脂肪分化。添加0.4 mg/m L APS促进棕色脂肪分化中脂滴的形成,显著地增加了棕色脂肪细胞分化相关转录因子的水平,包括脂肪分化标志蛋白C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ和产热关键转录因子UCP1、PRDM16、PGC-1α（P＜0.05）。（2）APS增强了BAT细胞的胰岛素敏感性。添加0.4 mg/m L APS显著提高了胰岛素信号通路的活性,增加了GLUT4蛋白的表达量（P＜0.05）。（3）验证了miR-6911与Prdm16之间的靶标关系。在测序结果中得到了40个差异表达的miRNAs,q RT-PCR结果显示miRNAs的表达量和测序结果一致,证明了测序的准确性。其中miR-6911的在实验组中表达极显著降低（P＜0.01）。经预测,miR-6911靶向棕色脂肪分化相关的靶基因Prdm16。双荧光素酶报告结果显示,miR-6911可显著降低含有Prdm16 3’UTR的双荧光报告载体的荧光强度（P＜0.01）,证明了miR-6911与Prdm16之间存在靶标关系。（4）miR-6911通过靶向Prdm16调节了棕色脂肪细胞的分化。转染miR-6911 mimics过表达miR-6911后,PRDM16蛋白表达量与对照组相比显著下降,PPARγ和UCP1、PGC-1α的蛋白表达水平也显著降低;抑制miR-6911表达则显示出相反的结果（P＜0.05）。因而,APS通过降低miR-6911的表达,促进了PRDM16的表达,影响C3H10T 1/2细胞棕色脂肪分化。（5）APS改变了棕色脂肪细胞分化中lncRNAs的表达谱。测序共得到134 50个lnc RNAs和577 76个m RNAs。通过对其表达量、长度、外显子个数和成对重复性检验分析证明了测序数据的可靠性较好。筛选共得到153个差异表达的lncRNAs和1238个差异表达的mRNAs。结果表明,差异mRNAs主要GO注释富集在53个功能分类中,KEGG分析富集在343条通路中。差异lnc RNAs顺式及共表达作用预测的靶基因GO注释分别富集在34和33个功能分类中,在分子功能中条目一致。KEGG分析显示,多个基因富集在脂肪代谢和脂肪分化的信号通路中,尤其在胰高血糖素及c AMP信号通路中富集显著。综上,APS改变了棕色脂肪细胞分化中lnc RNAs的表达谱。综上,添加APS有效地促进了C3H10T 1/2细胞棕色脂肪化,增加了胰岛素敏感性。APS通过改变miRNA-6911表达,进而靶向Prdm16调控棕色脂肪化。此外,APS改变了棕色脂肪分化中lnc RNAs的表达谱。本研究结果对合理利用APS调控BAT分化,进而影响产热提供了理论依据。
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