论文部分内容阅读
研究目的以人急性髓系白血病HL-60、THP-1细胞株为研究对象构建白血病体外研究的模型,旨在研究G-CSF如何通过调控miR-146a/CXCR4和miR-146a/Smad4信号通路影响处于骨髓微环境保护中的白血病细胞增殖活性,细胞周期及趋化能力等细胞生物学行为,阐释G-CSF增强化疗药物对白血病细胞杀伤作用的分子机制,并结合临床数据分析G-CSF对急性髓性白血病病人总生存率和无复发生存率的影响,探讨CXCR4和miR-146a作为临床标志物的可能性及对于疾病预后的预测意义。实验方法和结果第一部分人急性髓系白血病HL-60、THP-1细胞株中转染miR-146a过表达及抑制表达质粒,经G-CSF 100ng/ml预处理48h或不做任何处理后,用RT-qPCR法检测细胞内miR-146a、CXCR4 mRNA表达情况,Western Blotting法检测细胞内总CXCR4蛋白表达情况,流式细胞术检测表面CXCR4蛋白表达,PI/Annexin V双染法检测细胞凋亡情况,通过建立HS-5/白血病细胞共培养模型模拟骨髓微环境与白血病细胞之间的相互作用,验证骨髓基质细胞对白血病细胞的保护作用,并通过构建transwell小室模型,比较不同组别间的细胞趋化能力。结果表明,G-CSF可以通过上调miR-146a的水平降低白血病细胞内CXCR4表达,从而增加细胞的趋化,最终增加阿糖胞苷对其杀伤作用。第二部分人白血病HL-60细胞株中转染miR-146a过表达及抑制表达质粒后,经G-CSF100ng/ml预处理48h或不做任何处理后,用RT-qPCR法检测细胞内Smad4mRNA的表达,Western Blotting法检测细胞内Smad4蛋白表达,CCK8法检测细胞增殖活性,PI/Annexin V双染法检测细胞凋亡情况,流式细胞术检测细胞周期变化。结果表明,经G-CSF处理后,HL-60细胞内miR-146a表达上调伴随Smad4基因蛋白表达下调,进入细胞周期的细胞增殖活性增高,最终增强HL-60细胞对阿糖胞苷的敏感性。第三部分收集我院近十年初发AML患者的临床资料,根据化疗方案中有无包含G-CSF分为两组,通过绘制Kaplan-Meier生存曲线分析其对OS和RFS的影响,并通过单因素和多因素Cox回归分析来推断G-CSF使用及其他预后因素对AML患者远期生存及复发的预测意义。接着选取8例临床标本,Ficoll法分离出单个核细胞后,分别用Western blotting和RT-qPCR法检测细胞内CXCR4蛋白及miR-146a、CXCR4 mRNA的表达情况,再用100ng/ml G-CSF预处理其中4株原代细胞,分析其基因蛋白变化,最后用RT-qPCR法检测G-CSF(+)患者化疗前后细胞内miR-146a及CXCR4 mRNA变化情况,并分析其与远期预后之间的相关性。分析结果表明G-CSF可以延长AML患者的总生存期,但对于预测远期生存及复发尚未发现显著统计学意义。AML患者骨髓原代细胞中miR-146a与CXCR4表达呈负相关,且G-CSF可以上调原代细胞中miR-146a水平并降低CXCR4表达。在所有化疗方案中包含G-CSF的患者中,使用G-CSF后细胞内CXCR4显著降低或miR-146a显著增高的患者总生存期及无复发生存期较长,且CXCR4高表达患者中,使用G-CSF后CXCR4表达显著降低的患者远期预后也较好。结论G-CSF可以分别通过调控miR-146a/CXCR4和miR-146a/Smad4信号轴影响CXCR4和Smad4表达,促进白血病细胞从骨髓造血龛中释放到外周,打破骨髓基质对白血病细胞的保护作用,同时刺激处于静止状态的白血病细胞进入细胞增殖阶段,增强其对阿糖胞苷的敏感性,最终延长AML病人的总生存期。