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核移植技术对科学研究具有重要意义，近年来，体细胞的核移植技术发展迅速。本实验用山羊的输卵管上皮细胞进行核移植研究，建立了相应的核移植技术程序，如固定针和注射针的制作，卵母细胞的体外成熟培养，成熟卵母细胞的去核，输卵管上皮细胞移入卵母细胞的卵周隙，去核卵母细胞-输卵管上皮细胞复合体的电融合，重组胚的激活和培养等。 在本实验中，从屠宰场收集山羊的卵巢，获得卵丘-卵母细胞复合体（COCs），复合体移入含有成熟培养液微滴的培养皿中，上面覆盖石蜡油，置于38℃、5％CO2的培养箱中培养。为比较不同的培养液对卵母细胞体外成熟率的影响，将卵丘-卵母细胞复合体培养在三种不同的培养液中：ⅠM199+10％EGS+1iu／ml HCG+1ug／ml 17-β-E2；ⅡM199+10％EGS+1iu／ml HCG；Ⅲ M199+10％FCS+1iu／ml HCG+1ug／ml 17-β-E2。组Ⅰ、组Ⅱ和组Ⅲ的卵母细胞成熟率分别是80.85％、51.47％和63.86％，结果表明，组Ⅰ的卵母细胞成熟率显著高于组Ⅱ（p＜0.01）和组Ⅲ（p＜0.05）的成熟率。 卵母细胞成熟后，在培养皿中用斜口拔尖的针对其进行去核，并将输卵管上皮细胞移入卵周隙中。卵母细胞去核后，用乙酸地衣红染色，去核率达74.42％（32／43）。 山羊的输卵管上皮细胞体外培养时，培养液的血清浓度从10％降至0.5％，诱导输卵管上皮细胞处在细胞周期的G0期，用作核供体细胞进行核移植。 去核卵母细胞-输卵管上皮细胞复合体用直流电脉冲进行融合，两电极相隔约3倍卵径距离，当脉冲电压分别是30V、40V、50V和60V时，电融合率分别是29.17％、44.83％、50.79％和46.3％，当脉冲宽度分别是40us、50us和60us时，电融合率分别是30.23％、48.48％和43.55％，结果表明，当脉冲电压是40V，50V和60V或脉冲宽度是50us和60us时，电融合率无显著差异，但显著高于脉冲电压为30V或脉冲宽度是40us时的电融合率（p＜0.05）。 山羊输卵管上皮细胞核移植的研究二 融合后形成的重组胚用离子霉素Oonom卯in)或离于霉素峭－ 二甲氨基瞟吟“十MAP)进行激活处理，重组胚的卵裂率分别是20．45％ 和 35．85丸结果表明，后者的卵裂率显著高于前者…们．05人 但它 们的卵裂率均显著高于不进行激活处理的对照组。 激活后，将重组胚培养于两种不同的培养系统中：I M199＋15％FCS；11 M199＋15％FCS＋GOE Feeder。组 1和组＊的个细胞 期胚胎发育率分别是 23．sl％和 28．3儿 桑甚胚发育率分别是0％和 9．43丸 结果表明，组1和组＊的个细胞期胚胎发育率无显著差异， 而组11的桑甚胚发育率显著高于组1 …州．05人 本实验的结论是： 门)卵母细胞体外成熟培养时，在培养液中添加发情羊血清“GS) 和雌二醇门－p《。人可显著提高卵母细胞的成熟率。 Q)在培养Illl中用斜口拔尖的针对卵母细胞进行去核，并将输卵叶 管上皮细胞移入卵母细胞的卵周隙中，会节省体外操作的时间，有益 于胚胎的发育。 Q)直流脉冲电压、脉冲宽度均影响融合率，对山羊去核卵母细 胞－输卵管上皮细胞复合体来说，当两针电极相隔约3倍卵径距离时， 脉冲电压为50V，脉冲宽度为50US，2次脉冲，脉冲间隔为0．SS是 一合适的电融合参数。 m重组胚用离子霉素和6－二甲氨基膘吟先后进行激活处理，会 显著提高重组胚的卵裂率。 D)重组胚体外培养时，以山羊的输卵管上皮细胞作饲养层，可 显著提高重组胚的桑甚胚发育率。