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核移植技术对科学研究具有重要意义,近年来,体细胞的核移植技术发展迅速。本实验用山羊的输卵管上皮细胞进行核移植研究,建立了相应的核移植技术程序,如固定针和注射针的制作,卵母细胞的体外成熟培养,成熟卵母细胞的去核,输卵管上皮细胞移入卵母细胞的卵周隙,去核卵母细胞-输卵管上皮细胞复合体的电融合,重组胚的激活和培养等。 在本实验中,从屠宰场收集山羊的卵巢,获得卵丘-卵母细胞复合体(COCs),复合体移入含有成熟培养液微滴的培养皿中,上面覆盖石蜡油,置于38℃、5%CO2的培养箱中培养。为比较不同的培养液对卵母细胞体外成熟率的影响,将卵丘-卵母细胞复合体培养在三种不同的培养液中:ⅠM199+10%EGS+1iu/ml HCG+1ug/ml 17-β-E2;ⅡM199+10%EGS+1iu/ml HCG;Ⅲ M199+10%FCS+1iu/ml HCG+1ug/ml 17-β-E2。组Ⅰ、组Ⅱ和组Ⅲ的卵母细胞成熟率分别是80.85%、51.47%和63.86%,结果表明,组Ⅰ的卵母细胞成熟率显著高于组Ⅱ(p<0.01)和组Ⅲ(p<0.05)的成熟率。 卵母细胞成熟后,在培养皿中用斜口拔尖的针对其进行去核,并将输卵管上皮细胞移入卵周隙中。卵母细胞去核后,用乙酸地衣红染色,去核率达74.42%(32/43)。 山羊的输卵管上皮细胞体外培养时,培养液的血清浓度从10%降至0.5%,诱导输卵管上皮细胞处在细胞周期的G0期,用作核供体细胞进行核移植。 去核卵母细胞-输卵管上皮细胞复合体用直流电脉冲进行融合,两电极相隔约3倍卵径距离,当脉冲电压分别是30V、40V、50V和60V时,电融合率分别是29.17%、44.83%、50.79%和46.3%,当脉冲宽度分别是40us、50us和60us时,电融合率分别是30.23%、48.48%和43.55%,结果表明,当脉冲电压是40V,50V和60V或脉冲宽度是50us和60us时,电融合率无显著差异,但显著高于脉冲电压为30V或脉冲宽度是40us时的电融合率(p<0.05)。 山羊输卵管上皮细胞核移植的研究二 融合后形成的重组胚用离子霉素Oonom卯in)或离于霉素峭- 二甲氨基瞟吟“十MAP)进行激活处理,重组胚的卵裂率分别是20.45% 和 35.85丸结果表明,后者的卵裂率显著高于前者…们.05人 但它 们的卵裂率均显著高于不进行激活处理的对照组。 激活后,将重组胚培养于两种不同的培养系统中:I M199+15%FCS;11 M199+15%FCS+GOE Feeder。组 1和组*的个细胞 期胚胎发育率分别是 23.sl%和 28.3儿 桑甚胚发育率分别是0%和 9.43丸 结果表明,组1和组*的个细胞期胚胎发育率无显著差异, 而组11的桑甚胚发育率显著高于组1 …州.05人 本实验的结论是: 门)卵母细胞体外成熟培养时,在培养液中添加发情羊血清“GS) 和雌二醇门-p《。人可显著提高卵母细胞的成熟率。 Q)在培养Illl中用斜口拔尖的针对卵母细胞进行去核,并将输卵叶 管上皮细胞移入卵母细胞的卵周隙中,会节省体外操作的时间,有益 于胚胎的发育。 Q)直流脉冲电压、脉冲宽度均影响融合率,对山羊去核卵母细 胞-输卵管上皮细胞复合体来说,当两针电极相隔约3倍卵径距离时, 脉冲电压为50V,脉冲宽度为50US,2次脉冲,脉冲间隔为0.SS是 一合适的电融合参数。 m重组胚用离子霉素和6-二甲氨基膘吟先后进行激活处理,会 显著提高重组胚的卵裂率。 D)重组胚体外培养时,以山羊的输卵管上皮细胞作饲养层,可 显著提高重组胚的桑甚胚发育率。