刚地弓形虫是从属于顶复门原虫的专性细胞内寄生原虫,能感染几乎所有的温血动物,危害严重。但是迄今为止还没有研制出能够有效预防弓形虫病的疫苗。糖酵解是所有细胞中重要的代谢途径,弓形虫中大多数糖酵解酶都有两个亚型,且多数酶的两个亚型之间存在定位差异或表达时期差异。这些酶的不同亚型在虫体中的生物学功能以及它们时期差异表达的调控机制目前尚不清楚。聚焦这些科学问题,本研究以定位于胞质中的3-磷酸甘油酸激酶1（PGK1）以及定位于顶质体的3-磷酸甘油醛脱氢酶2（GAPDH2）为研究对象,研究不同亚细胞定位的糖酵解酶的功能,同时选择在速殖子时期特异表达的烯醇酶2（ENO2）为对象,研究其时期特异性表达的调控机制。取得的主要结果包括:1.胞质中PGK1在弓形虫生长代谢中的作用3-磷酸甘油酸激酶（PGK）催化1,3-二磷酸甘油酸（1,3-BPG）转化为3-磷酸甘油酸（3-PG）,同时生成一分子ATP。弓形虫编码两个PGK,包括定位于胞质中的PGK1和顶质体中PGK2,但是它们在虫体中的生物学功能不甚清楚。本研究利用CRISPR/Cas9技术辅助的同源重组技术,在TATi虫株中将PGK1基因的启动子替换成受脱水四环素调控的启动子,从而构建了条件性敲低虫株iPGK1。体外表型实验显示抑制PGK1的表达会减缓正常培养条件下弓形虫的生长,但是如果移除培养液中的葡萄糖,PGK1敲低虫株的生长得到了较好的恢复,提示敲低PGK1可能会造成葡萄糖降解中有毒代谢物的积累从而抑制虫体生长。这些研究结果表明PGK1对弓形虫正常代谢虫体的主要碳源葡萄糖有关键作用,并且对虫体的生长繁殖至关重要。2.顶质体中GAPDH2的功能研究与PGK一样,弓形虫也编码两个GAPDH,其中GAPDH2定位于顶质体中,但是它在顶质体代谢以及虫体生长中扮演的角色却不清楚。本研究试图通过对GAPDH2基因进行遗传改造以研究其功能。首先尝试直接敲除该基因,但多次试验均未能得到阳性的缺失虫株,提示该基因可能对虫体的生长非常关键。接着在DiCre虫株中将GAPDH2基因置于两个LoxP位点之间,试图通过Cre介导的重组来诱导GAPDH2的敲除,我们成功得到了DiCre/LoxP-GAPDH2虫株,但是由于未知的原因Cre重组酶并不能切除LoxP位点间的GAPDH2。我们怀疑是GAPDH2基因所在位点的特殊染色体结构阻碍了Cre的工作效率,于是尝试先将LoxP-GAPDH2插入到UPRT位点,然后再敲除内源性的GAPDH2基因。我们也成功得到了DiCre/uprt::LoxP-GAPDH2虫株,且该虫株LoxP位点间的GAPDH2确实可以被Cre切除,但是我们还是不能将内源性的GAPDH2敲除掉。然后我们尝试了第三种策略,在内源性的GAPDH2基因的3’端加一个AID（Auxin Induced Degradation）标签,通过添加auxin诱导GAPDH2的降解来敲低它,我们成功构建了Tir1/GAPDH2-AID虫株,但是auxin并不能诱导GAPDH2的降解,可能是因为该蛋白定位于顶质体,不容易把胞质中的蛋白酶体降解。因此,尽管进行了各种尝试,但是可能由于GAPDH2基因位点的特殊结构以及它的顶质体定位,目前尚没有得到能实现其表达调控的虫株,这也提示了目前弓形虫条件性遗传改造系统存在的局限性。3.G4链体对ENO2在速殖子中特异表达的调控作用ENO在弓形虫中同样有两个亚型,分别为在缓殖子时期高表达的ENO1和在速殖子时期高表达的ENO2,但是这两个亚型呈现时期表达差异的调控机制尚不清楚。我们发现在ENO2的5’UTR区域含有一个典型的G4链体的形成序列（PQS）,通过圆二色谱验证了该PQS确能形成G4链体,提示它可能参与了ENO2的表达调控。同时利用G4Hunter预测软件预测出弓形虫全基因组中所有的PQS,生物信息学分析发现,含有PQS的基因中,有44.37%的基因其在速殖子阶段表达上调;51.69%的基因在裂殖子阶段表达上调,并且几乎所有的糖酵解酶都含有PQS,因此我们猜测G4可能参与了弓形虫糖酵解酶时期差异表达的调控。综上,本研究选取了弓形虫糖酵解酶中具有代表性的三种酶PGK1、GAPDH2与ENO2。验证了PGK1对弓形虫正常代谢葡萄糖有关键作用,并且对虫体的生长至关重要。试图通过对GAPDH2基因进行遗传改造以研究其功能,为后续相关研究提供经验。初步分析了弓形虫全基因组中PQS并预测5’UTR中的G4链体对ENO2潜在的表达调控作用。