背景：脑出血(intracerebral hemorrhage, ICH)是指原发性脑实质内血管破裂引起的出血,具有高发病率、高死亡率和高致残率的特点。目前临床上仍无有效的治疗方法用于改善幸存者的神经功能缺陷。实验证明神经干细胞移植能够促进脑出血后神经功能的恢复。目前,神经干细胞主要从胚胎干细胞诱导或是直接从发育中和成年哺乳动物的中枢神经系统中分离培养获得。但是伦理学、安全性问题以及细胞来源和数量的有限,在一定程度上都限制了神经干细胞的移植应用。因此,很有必要寻找其它能够获得神经干细胞的途径来克服这些限制。研究发现采用碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)和表皮细胞生长因子(epidermal growth factor, EGF)可直接诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BMSC)向神经干细胞(nerual stem cell, NSC)转化。最近,脐带(Umbilical cord, UC)被发现可以作为间充质干细胞的理想来源,因此脐带MSC (UC-MSC)是否可以诱导转化为神经干细胞以及获得的神经干细胞能否促进脑出血后神经功能的恢复,很值得我们去研究。目的：探讨体外诱导人UC-MSC向神经干细胞转化的可行性；建立大鼠脑出血模型,探讨获得的神经干细胞移植后在大鼠脑内的存活、分布和分化情况以及对神经功能恢复的影响,为人UC-MSC在神经科学领域的临床应用提供理论依据和实验基础。方法：取足月妊娠剖宫产的新生儿脐带,利用酶消化法和贴壁法获得原代细胞,传4-6代后备用。在添加了bFGF、FGF8、SHH和LIF的DMEM／DF-12完全培养基中预诱导UC-MSC 6-8天,然后消化重新接种在添加了bFGF、FGF8、SHH和2%N2／B27的neurobasal media中,定向诱导大约20天后获得神经干细胞(NSC derived fromUC-MSC,UC-NSC)。一方面,通过real-time RT-PCR和免疫荧光染色分别检测mRNA和蛋白水平上Nestin、NeuroD1、Tubulin、GFAP、Galc以及Fibronectin的表达情况。另外,体外诱导UC-NSC向神经元和神经胶质细胞分化,进一步鉴定其是否具有神经干细胞的特点。另一方面,通过流式细胞学以及成骨和成脂能力来检测UC-NSC的细胞免疫表型以及向中胚层分化的能力,鉴定其是否丧失了UC-MSC的特性。此外,为了进一步研究UC-NSC的治疗潜能,我们将其移植至大鼠脑出血模型中,观察其对神经功能恢复的影响。建模后24小时,将CM-Dil标记的UC-MSC和UC-NSC移植至血肿周围。在移植后的7周每周都采用mNSS和MLPT两种方法进行一次神经功能评价。于移植后3天,通过“干湿重法”进行脑水容量分析。于移植后3天和7天,通过免疫组化染色观察IL-1β在大鼠脑内的表达情况；在移植后35天,制备脑冰冻切片,观察移植细胞在脑内的存活、分布和分化情况。此外,通过免疫荧光染色GFAP分析损伤区周围胶质细胞增殖情况,并测量了胶质瘢痕的厚度。同时,我们还进行结晶紫／速兰染色显示其损伤区域,检测了各组脑出血损伤体积的变化。结果：人UC-MSC在体外可以诱导转化为UC-NSC,并且获得的UC-NSC不仅具有神经干细胞的特点,同时也丧失了UC-MSC的特性。UC-NSC移植至大鼠脑出血模型后,能够在宿主脑内存活、迁移和分化为神经元和星形胶质细胞。与PBS对照组相比,UC-NSC移植组的脑水肿和胶质瘢痕的发生明显减少,且损伤区周围IL-1β阳性细胞也少于对照组。此外,mNSS和MLPT评分也明显优于对照组。结论：1.人UC-MSC在体外可以诱导转化为UC-NSC；2.UC-NSC可以有效地促进大鼠脑出血后神经功能的恢复。背景：脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)是造成截瘫的主要原因,同时也是人类致残率最高的疾病之一。目前,国内外治疗SCI的方法多局限于脊柱骨脱位的复位固定和药物治疗以达到解除脊髓压迫、减轻细胞水肿和继发性损伤以及改善微循环等对症治疗的目的,但疗效不佳。细胞移植治疗SCI是近年来的研究热点。研究表明移植的细胞可在损伤部位存活、迁移且能分化为神经细胞促进神经功能的恢复。胚胎干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、脐血干细胞以及嗅鞘细胞等均己被作为移植细胞用于脊髓损伤的神经修复治疗。特别是间充质干细胞,相对于其它细胞具有多方面的优点,因此近年来倍受研究者的关注。实验证明移植骨髓间充质干细胞能够促进大鼠脊髓损伤后神经功能的恢复。但取材困难,供体有限,易并发病毒感染以及年龄增长造成的增殖能力和多向分化能力的下降等都使骨髓间充质干细胞的临床应用受到了一定的限制。最近,作为“废弃物”的脐带(Umbilical cord,UC)被发现可以作为间充质干细胞的理想来源,相对于骨髓,从脐带中分离的MSC具有组织来源丰富、细胞原始、增殖能力强和安全无病毒感染风险等优点,因此脐带间充质干细胞(UC-MSC)是否可以成为治疗脊髓损伤的理想种子细胞,值得进我们去研究。目的：建立犬脊髓损伤模型,初步探讨人UC-MSC移植对犬脊髓损伤后神经功能恢复的影响,为细胞移植治疗寻找一种具有良好应用前景的种子细胞提供理论依据和实验基础。方法：人UC-MSC来源于足月妊娠剖宫产的健康胎儿脐带,用酶消化法和贴壁法获得原代细胞,消化传代后,取P4-P6代的细胞备用。通过流式细胞学和成骨、成脂能力来检测细胞的免疫表型和多向分化能力从而进一步鉴定UC-MSC。采用闭合液压打击法制备犬脊髓损伤模型。将实验动物随机分为两组,即UC-MSC组和对照组(PBS组)。1)UC-MSC组：脊髓损伤后1周移植1×106个UC-MSC；2)对照组：脊髓损伤后1周移植同体积的PBS。分别于模型制备后1周和UC-MSC移植后1、2、4、6、8、16、24周,采用改良Tarlov评分对动物进行行为学评分。采用SIEMENS MagnetomVision超导MRI,分别于模型制备后1周、UC-MSC移植后1周及6周进行影像学检测,动态观察损伤后的脊髓。于移植24周后处死细胞移植组和对照组的实验动物,取出损伤的脊髓组织制备石蜡切片,Luxol fast blue/cresyl violet(结晶紫／速兰)染色观察组织病理改变情况。结果：流式细胞学方法检测人UC-MSC的免疫表型,结果发现其高表达CD90、CD29、CD73和CD105；不表达造血干细胞标记CD34、CD45和内皮细胞特异性标记CD31。此外,UC-MSC表达中等水平的HLA-ABC而不表达HLA-DR,提示UC-MSC具有异体移植的可行性。在特定培养条件下,UC-MSC能够成骨和成脂,说明其具有多向分化能力。以上证实移植细胞为人UC-MSC。犬脊髓损伤后,UC-MSC移植组较对照组有明显的神经功能恢复,其改良Tarlov评分具有显著差异。MRI显示UC-MSC组细胞移植后,脊髓创伤区T2WI的高信号逐渐增多,而对照组则表现为不规则高信号环绕中心低的“环征信号”。Luxol fast blue/cresyl violet染色后发现UC-MSC移植组的脊髓填充坏死区的纤维组织较对照组明显减少,而且其周边可见散在的神经元分布,无核固缩,尼氏体染色较深。结论：人UC-MSC能够促进犬脊髓损伤后的神经功能恢复。