恙虫病是由节肢动物传播的革兰阴性专性细胞内细菌恙虫病东方体引起的严重威胁公共卫生安全的人畜共患病。其在亚太地区广泛流行,从阿富汗延伸到中国、朝鲜、西南太平洋岛屿和澳大利亚北部,每年导致100万人患病,威胁着全球近10亿人的健康。非洲和南美国家的血清学证据表明,该疾病的地理范围和风险群体的人口可能更大。我国属于恙虫病重点疫区之一,发病率较高,死亡率在1.4%-6%之间严重威胁我国人民的健康。既往研究提示,恙虫病在我国北纬31°以南的广大地区流行,具有显著的季节特征,以夏季型为主。自1986年首次报道恙虫病在山东流行以来,新疫区不断形成和扩散,该类地区流行季节也与南方地区不同,为秋冬季,导致疾病特点发生了较大变化,恙虫病东方体的遗传背景、致病特点、毒力强度也可能发生了变异,并且逐渐向致病力较强的菌株发展。立克次体类疾病主要引起发热、皮疹、淋巴结肿大等症状,其临床特征不能有效区别于其他发热性疾病,常误诊导致病情加重,从而引发多器官损害等致命性疾病。鉴于恙虫病东方体在常规实验室条件下难以稳定培养和传代,对实验室培养条件和实验人员的要求较高,该菌株的培养不仅需要大量的正常细胞来获取分离菌株,而后续的相关研究更需要大量的纯化菌株,以上等综合原因使得国内研究者较少,而国际上对于恙虫病的致病机理研究极其稀少,目前我国对其致病机制的研究也尚属空白,因此建立经济且快速的诊断方法至关重要。本研究试图建立一种灵敏度与特异性相对较高且易于操作的恙虫病快速诊断方法,同时为了从根本上消灭恙虫病东方体感染,寻找合适的靶点来进行疫苗的开发,本研究通过建立小鼠动物模型来模拟疾病的感染过程,以期为恙虫病的防治提供一定的借鉴意义。本课题着重开展了四个部分的研究:第一部分研究根据恙虫病东方体外膜蛋白TSA以及HtrA基因序列设计特异性引物,构建TSA、HtrA基因的克隆与原核表达载体,进行两种蛋白的诱导表达及条件优化。结果显示构建了TSA及HtrA蛋白体外稳定表达的大肠杆菌菌株,同时纯化得到较高的蛋白浓度,为后续的进一步实验奠定了基础。第二部分研究初步建立恙虫病东方体病原检测方法,胶体金快速检测方法:将保存的能够用稳定表达TSA、HtrA蛋白的大肠杆菌菌株复苏,进行蛋白诱导表达纯化,体外获得纯度较高的蛋白后,利用胶体金进行标记,并对所建立的方法进行初步评价,结果显示利用临床确诊标本及健康人的标本进行验证,发现该方法具有较高的准确性,且大大缩短了检测时间与检测成本。免疫荧光抗原片检测方法:将保存的恙虫病东方体菌种复苏,感染L929细胞,制备细胞悬液后抗体孵育制作检测抗原片,初步结果显示该方法成本较低且具有良好的准确性。第三部分初步研究TSA、HtrA的抗原性,分别用两种蛋白刺激HUVECs细胞,观察TSA、HtrA对HUVECs细胞表型的影响,同时利用荧光定量PCR检测相关细胞因子的变化。结果显示,与对照组相比实验组的相关细胞因子水平显著升高。第四部分恙虫病东方体感染小鼠模型的构建及其引起的细胞因子风暴:首先将保存的恙虫病东方体菌株复苏,感染L929细胞多次优化培养条件使其能够大量克隆。收集细胞培养物反复多次进行细胞破碎后进行差速离心超纯后得到高浓度的立克次体悬液,最终进行定量浓度为1×10~8copies/μl,通过腹腔接种途径感染I型干扰素敲除小鼠及天然免疫缺陷TLR4小鼠,记录小鼠体征、体温、体重等基本信息,同时采集血液和脏器标本。通过病理切片HE染色、荧光定量PCR、免疫组织化学染色等方法进行相关指标检测,结果显示与对照组相比,I型干扰素敲除实验组的小鼠的活动度等指标在感染后的第八天出现显著变化,且在感染后的第十天发生死亡,TLR4受体天然缺陷组的小鼠活动度及状态未见明显差异,同时结合HE染色、免疫组化结果,实验组小鼠出现明显的炎症细胞浸润,细胞炎性因子水平较高。本研究成功于体外表达了恙虫病东方体两种特异性蛋白,初步建立了基于恙虫病东方体TSA蛋白的胶体金快速检测方法和免疫荧光抗原片法的临床诊断,为临床实验室确诊恙虫病及立克次体类疾病提供了快速有效的技术手段。TSA、HtrA蛋白对HUVECs细胞产生致病性,为进一步探究立克次体类胞内菌的致病机制奠定了基础,而小鼠模型的建立,肺部及脾脏的损伤由于恙虫病东方体感染后的患者表现类似,可作为恙虫病东方体致病性研究的体内模型,结合不同小鼠模型的情况对立克次体感染动物的致病性进行初步探究。