【摘 要】
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目的:建立脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导小鼠乳腺炎动物模型、细胞模型及乳腺炎本源动物细胞模型。分析阐明甘草酸的抗乳腺炎作用机制。方法:(1)甘草酸抑菌体外实验甘草酸对造成奶牛乳房炎的主要病原菌大肠杆菌、无乳链球菌和金黄色葡萄球菌进行最低抑菌试验和杀菌效果检验。(2)LPS诱发的小鼠乳腺炎性损伤模型的建立(1)通过肉眼观察LPS刺激组雌鼠的乳腺组织的病理学变化;(2)对获
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目的:建立脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导小鼠乳腺炎动物模型、细胞模型及乳腺炎本源动物细胞模型。分析阐明甘草酸的抗乳腺炎作用机制。方法:(1)甘草酸抑菌体外实验甘草酸对造成奶牛乳房炎的主要病原菌大肠杆菌、无乳链球菌和金黄色葡萄球菌进行最低抑菌试验和杀菌效果检验。(2)LPS诱发的小鼠乳腺炎性损伤模型的建立(1)通过肉眼观察LPS刺激组雌鼠的乳腺组织的病理学变化;(2)对获得的雌鼠乳腺组织分别制作组织病理学切片和髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)的免疫组织化学切片,观察乳腺的病理组织学变化和MPO在组织中的分布及活性;(3)通过ELISA方法检测乳腺组织中TNF-α表达水平。(3)甘草酸对LPS诱发的小鼠乳腺炎损伤的保护作用(1)观察乳腺组织的病理学变化和MPO的分布与活性;(2)ELISA方法检测乳腺组织中TNF-α、IL-1β和IL-6等细胞因子的表达水平,荧光定量PCR方法检测各细胞因子的mRNA表达水平;(3)Western blot、荧光定量PCR方法检测甘草酸对TLR4/NF-κB通路上的IκBα、p65和MAPK通路上的p38、JNK和ERK蛋白表达水平和基因表达水平的影响。(4)甘草酸对LPS刺激的小鼠乳腺上皮细胞的保护作用(1)利用MTT方法检测甘草酸对小鼠乳腺上皮细胞的毒性作用;(2)ELISA方法检测甘草酸对小鼠乳腺上皮细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子的表达水平,荧光定量PCR分析TNF-α,IL-1β和IL-6的mRNA表达水平;(3)Western blot、荧光定量PCR方法检测甘草酸对NF-κB通路上的IκBα、p65和MAPK通路上的p38、JNK和ERK蛋白表达水平和mRNA转录水平的影响。(5)甘草酸对LPS刺激的奶牛乳腺上皮细胞的保护作用(1)利用MTT方法检测甘草酸对奶牛乳腺上皮细胞的毒性作用;(2)ELISA方法检测甘草酸对奶牛乳腺上皮细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6等细胞因子的表达水平,荧光定量PCR分析TNF-α,IL-1β和IL-6的mRNA水平;(3)Western blot、荧光定量PCR方法检测甘草酸对NF-κB通路上的IκBα、p65和MAPK通路上的p38、JNK和ERK蛋白表达水平和mRNA表达水平的影响。结果:甘草酸体外能不同程度抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和无乳链球菌;在LPS诱发的小鼠乳腺炎模型中,基于组织病理、免疫组化、ELISA、荧光定量PCR、Western blot等实验研究表明:(1)不同浓度的甘草酸能够抑制LPS诱发的小鼠乳腺炎;(2)不同浓度甘草酸对LPS刺激的细胞(包括小鼠乳腺上皮细胞、奶牛乳腺上皮细胞),可降低TNF-α,IL-1β和IL-6的分泌和表达;(3)基于蛋白表达和mRNA转录检测分析表明:甘草酸能够抑制LPS诱导胞内NF-κB通路上的关键分子(IκBα、p65)和MAPK通路上的关键分子(p38、JNK和ERK)。结论:在实验动物水平、细胞水平和分子水平上,甘草酸可抑制细菌LPS诱导的炎症反应,该机理对于奶牛乳腺炎的防治具有指导意义。
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