伯克氏菌(Burkholderia)是伯克氏菌科的一个属,属于革兰氏阴性菌,广泛存在于水、土壤等环境中。随着基因组测序技术的发展,越来越多的伯克氏菌基因组被测序。通过对伯克氏菌属基因组进行生物信息学分析,我们发现在伯克氏菌属中存在着大量沉默的NRPS/PKS生物合成基因簇,具有潜在的次生代谢产物合成潜力。由于伯克氏菌属缺乏高效简捷的遗传操作方法,所以对伯克氏菌属的基因组功能的研究进展缓慢。为了加快对伯克氏菌属基因组研究的步伐,在伯克氏菌属中建立一套高效、简捷的遗传操作系统十分必要。Red/ET同源重组技术可以用来精确的修饰大肠杆菌的基因组,其中,RecET同源重组蛋白源自大肠杆菌Rac前噬菌体,Redαβγ同源重组蛋白源于大肠杆菌的λ噬菌体的Red操纵子。RecET和Redαβγ同源重组技术大大提高了大肠杆菌中的重组效率,并为遗传修饰提供了有效的技术方法。其中,RecE和Redα具有5’-3’的核酸外切酶活性,RecT和Redβ是DNA单链退火蛋白,Redγ能够抑制具有核酸外切酶活性的RecBCD蛋白对外源线性DNA的降解,从而提高重组效率。由于同源重组蛋白具有一定的宿主特异性,RecET和Redαβγ在其他的革兰氏阴性菌中效率很低或者不发挥作用。如果两种蛋白质具有30%左右的同源性,那么它们可能具有相似的功能。我们分别以RecE、RecT、Redα、Redβ的氨基酸序列为模板,使用NCBI的BlastP在线工具挖掘伯克氏菌属的同源重组蛋白。在伯克氏菌及其噬菌体基因组中搜索大肠杆菌λ噬菌体Red操纵子或者大肠杆菌Rac前噬菌体RecET操纵子类似的同源蛋白,我们分别在Burkholderia sp.BDU8、Burkholderia sp.TJI49和Burkholderia sp.YI23 中找到了与 RecET 类似的操纵子,分别是EThe_bdu8、ETh_tji49和ETh1h2e_yi23。在这三个操纵子的基础上,我们建立了不同的伯克氏菌属同源重组酶的表达质粒,作为不同伯克氏菌属中的理想的遗传修饰操作工具。通过对同源重组蛋白功能检测,确定了具有重组功能的蛋白。在此基础上,我们在Burkholderia glumae PG1中进行系统地电转条件和重组条件的优化。将构建的新型同源重组系统转化到几种不同的伯克氏菌中进行基因组修饰,成功激活了 3个沉默的NRPS/PKS基因簇。说明了该新型同源重组系统可以广泛应用与伯克氏菌属中。应用噬菌体重组酶构建新型同源重组系统,为伯克氏菌属提供了高效的遗传操作工具,新型同源重组系统将会被广泛应用于伯克氏菌属基因组的功能研究及遗传修饰。