目的急性脑缺血后发生继发性神经细胞损伤。细胞凋亡是继发性脑损伤中主要的细胞死亡形式,大量研究提示细胞凋亡机制参与脑缺血后继发性神经细胞损伤。细胞凋亡是影响脑缺血后神经损伤的重要因素,阻断细胞凋亡有望成为改善脑缺血预后的有效治疗措施。因此,在急性脑缺血继发脑损伤的治疗过程中,对抗凋亡的治疗成为关键。凋亡的生化指标包括:Bcl-2、Bax、p53、Caspase-3、HSP70等。其中Bcl-2的表达水平与脑缺血后缺血灶周围的继发损害密切相关。Bcl-2是B细胞淋巴瘤白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)基因的缩写,它是第一个被确认有抑制凋亡作用的基因。大量研究表明,检测Bcl-2的变化水平可以反映出细胞凋亡的程度。在目前抗凋亡治疗的研究中,亚低温治疗应用比较广泛。亚低温脑保护机制包括:①亚低温降低脑代谢率,延迟能量消耗。②亚低温抑制PMNL(分叶核白细胞)的聚集,从而抑制炎症因子的产生。③亚低温减轻钙离子内流。④亚低温抑制兴奋性氨基酸的释放。⑤亚低温抑制氧自由基的产生。⑥亚低温抑制一氧化氮合酶活性。⑦亚低温抑制神经元凋亡。有研究表明亚低温具有降低颅内压,防止神经细胞凋亡的作用。全身亚低温在神经外科手术中不利于操作,术后需缓慢复温,并且可能发生严重的全身并发症。选择性脑部低温,成为目前研究的重点,脑室内低温是其中的一种方式。而对急性脑缺血动物模型进行脑室内低温干预是否会起到对抗凋亡,从而保护脑组织的作用目前还不清楚。因此,本实验通过检测低温组和常温组兔急性脑缺血模型的缺血灶周围神经细胞凋亡及Bcl-2基因表达的差异,来检验脑室内低温在脑缺血时对神经细胞的抗凋亡作用,以期为临床治疗急性脑缺血提供一种新思路。材料与方法1、实验动物4—6个月龄雄性家兔24只,体重2.6—3.2Kg,随机分为两组:等温组(CH+等温液)、低温组(CH+低温液)各12只。2、麻醉全麻。实验前动物禁食12小时,不禁水。麻醉应用20%乌拉坦(5ml/kg)耳缘静脉注射,术中20%乌拉坦半量肌肉注射维持麻醉。3、大脑中动脉闭塞(MCAO)脑缺血模型建立采用线栓法制作家兔大脑中动脉闭塞(MCAO)脑缺血模型,缺血时间24小时。4、脑室内低温模型的建立脑缺血模型建立后,用双腔静脉微导管穿刺侧脑室,固定导管。导管一端为液体入口,另一端为脑室内液体流出口。等温组输入等温(38℃)等渗盐水,低温组输入冷却(20℃)等渗盐水,缓慢滴注,以相同速度持续引流,维持出入量的平衡。5、术后动物行为观察、Bcl-2及TUNEL染色术后缝合皮肤切口,动物置于室温饲养。术后24小时观察其肢体运动情况,此后过量麻醉下(20%乌拉坦静脉推注)处死后,迅速开颅取脑,4%多聚甲醛固定。固定72小时后,洗涤,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,浸蜡,常规石蜡包埋,在恒温切片机上制做成7um厚的冰冻切片,Bcl-2免疫组化染色及TUNEL染色均按试剂盒提供的实验步骤进行。6、图像采集每个标本在高倍镜下(×400)随机观察5个不重复视野,计数平均每个高倍视野的阳性细胞数及阴性细胞数,并计算阳性率。7、统计分析将数据输入SPSS12.0软件,同一指标的组间比较采用t检验,P＜0.05有统计学意义。结果1、动物行为观察常温组中有8只动物出现右侧肢体完全瘫痪,3只可以爬行,1只可以跳跃。低温组中有2只出现右侧肢体完全瘫痪,7只可以爬行,3只可以跳跃。与常温组比较,亚低温组动物肢体偏瘫程度低。2、脑组织细胞凋亡和Bcl-2表达的检测结果TUNEL染色阳性细胞核中呈现有棕黄色颗粒,Bcl-2染色阳性细胞浆中呈现有棕黄色颗粒。低温组的TUNEL染色阳性细胞数明显低于常温组,而Bcl-2染色阳性细胞数明显高于常温组。3、与常温组比较,亚低温组动物脑梗死体积小。4、统计学分析低温组的脑梗死体积、TUNEL染色阳性细胞数明显低于常温组,而Bcl-2染色阳性细胞数明显高于常温组,有显著差异。讨论Bcl-2是抗凋亡基因,在正常组织自身稳定方面起重要作用,其表达水平决定凋亡发生的程度。Bcl-2染色阳性细胞数越多,则抑制细胞凋亡的可能性越大。本实验结果表明:经脑室内低温保护的动物TUNEL染色阳性细胞数明显低于常温组,而Bcl-2染色阳性细胞数明显高于常温组,说明脑室内低温起到了减少缺血灶周围神经组织细胞凋亡的作用。结论经脑室内低温保护的动物偏瘫程度轻,缺血区脑组织内出现Bcl-2阳性细胞数较常温组要多,凋亡细胞较常温组要少,具有统计学意义。从本实验可以看出,对家兔急性大脑中动脉缺血模型进行脑室内低温保护干涉,可以减少缺血区域脑组织细胞凋亡,同时可以提高家兔的生存质量。因此,脑室内低温是一种值得继续探讨和关注的新临床治疗方法。