该博士论文由相对独立的两部分工作组成第一部分 原发性肝癌浸润性T淋巴细胞空间异质性分析背景:原发性肝癌(primary liver cancer,PLC),简称肝癌,是指在肝细胞或肝内胆管上皮细胞发生的恶性肿瘤,是我国常见的恶性肿瘤之一。流行病学研究显示,肝癌在全球癌症杀手中位列第2位,在中国,肝癌发病率居第4位,而死亡率却仅次于肺癌及胃癌居第3位。尽管近几年肝癌早期筛查、诊断和治疗技术不断提升,但是原发性肝癌的治疗效果仍不尽人意。应用肿瘤浸润淋巴细胞(tumour infiltrating lymphocytes,TILs)的免疫疗法在一些实体瘤病人中取得持久的疗效,最近的研究也表明PD-1抗体Nivolumab治疗晚期肝细胞癌患者具有可控的安全性和持久的客观缓解,提示我们免疫治疗应用于原发性肝癌临床治疗的可能性。由于对肝癌肿瘤微环境中TILs的空间分布、肿瘤局部特征基因和肿瘤突变负荷等基本生物学特征以及他们之间的相互联系所知甚少,因此有必要对TILs及其与肿瘤之间的相互作用进行深入解析。目的:通过对原发性肝癌患者肿瘤内不同区域和相应的癌旁组织及外周血进行TCRβ-链互补决定区 3(complementarity-determining region,CDR3)组库测序、mRNA表达谱芯片和全外显子组测序,揭示肝癌内TILs的空间分布,探索肿瘤内T细胞群多样性与局部分子表型或突变负荷间的关系。为肝癌的免疫治疗提供理论依据。材料和方法:我们的研究纳入5例病理诊断为肝癌的患者,通过手术收集肿瘤组织、癌旁组织及外周血样本,每例肿瘤组织按标准选取5个区域。组织石蜡切片判断肿瘤细胞所占的比例。通过多重PCR捕获和Illumina HiSeq 2500测序平台对TCRβCDR3区进行深度测序,同时采用mRNA表达谱芯片及IlluminaHiSeq 2000测序平台对相应组织的mRNA及外显子捕获试剂盒捕获后的DNA区段进行表达谱芯片分析和外显子组测序。同时我们将Patient 4肿瘤组织5个区域RNA提取物进行建库和TCR组库复测,评估抽样及测序技术引入的误差。结果:5例原发性肝癌患者的25个肿瘤组织样本测序所获得的unique TCRβ reads为 2.55×105～9.88×105个,癌旁组织为 3.33×105～7.51×105,外周血为 4.74×105～1.27×106,提示外周血中拥有比肿瘤组织和癌旁组织更多的T细胞类型(外周血vs肿瘤,p<0.001;外周血vs癌旁,p = 0.007)。肿瘤组织中频率最高的前250个TCRβ序列(TOP250 ubiquitous序列)的累计频率显著高于外周血(p =0.039),此外,每个患者肿瘤组织与肿瘤组织TCR组库之间的overlap显著高于肿瘤组织与正常组织或肿瘤组织与外周血TCR组库之间的overlap(肿瘤-肿瘤vs肿瘤-癌旁,p<0.001;肿瘤-肿瘤vs肿瘤-外周血,p<0.001)。每个肿瘤组织中都能检测到的TOP250序列在5例患者中所占比例从7.92%-24.07%(中位数10.93%),而75.93-92.08%(中位数89.07%)的T细胞克隆为多样性克隆。相关分析表明TILs克隆多样性与肿瘤局部T细胞免疫评分(T cell infiltration score,TIS)及总免疫细胞评分(overall immune infiltration score,IIS)正相关(RshannonD1vsTlS=0.852,p<0.001;RshannonD1vsTlS=0.798,p<0.001),同时发现TILs克隆多样性和TIS评分较高的肿瘤区域其PD-1表达和抗原提呈装置(antigen presenting machinery,APM)也相对其他区域高(RshannonDIvs PD-1=0.613,p=0.001;RTIs vs PD-1=0.641,p=0.001;RshannonDI vs APM=0.574,p=0.003;RTISvsPD-1=0.56,p=0.004)。值得注意的是,T细胞群多样性与肿瘤组织的非同义体细胞突变的数目无显著相关(R=-0.288,p=0.163),肿瘤细胞突变负荷与APM也无显著相关(R=-0.317,p=0.123)。结论:(1)肝癌患者肿瘤组织微环境内存在肿瘤相关的T细胞。(2)肿瘤组织中TILs的分布具有空间异质性。(3)肿瘤组织内TILs多样性和PD-1表达都存在空间异质性,提示肿瘤微环境在免疫治疗方案制定中非常关键。(4)提高肿瘤组织的APM是提高免疫治疗应答的关键。第二部分原发性肝癌患者循环肿瘤细胞检测与预后关系研究背景:原发性肝癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。目前,肝癌的临床治疗手段主要有手术切除、肝移植、介入治疗、射频消融、放化疗、分子靶向及免疫治疗,首选治疗方式为手术切除和肝移植。研究发现,无论采用何种治疗方法,改善患者术后生存的主要瓶颈均为术后不可避免的复发转移。因此,肝癌术后复发、转移也成为了制约手术疗效的主要因素。目前临床上主要通过影像学检查、血清标志物等手段来对肝癌进行诊断、治疗和监测,但效果均不理想。自从循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)概念被提出,CTCs逐步进入更多研究者的视野。由于CTCs是原发灶肿瘤的一部分,具有与原发灶肿瘤相似甚至相同的特性,因而部分学者认为,CTCs可以作为一种代表原发灶肿瘤的“液态活检标本”或“标记物”。随着对CTCs在不同肿瘤复发转移进程中的作用进行系统而深入的研究,人们发现若能采取有效的方式对肿瘤患者进行外周血CTCs检测,不仅有助于肿瘤的早期诊断及治疗监测,还可以有效的对预后进行预测。目的:分析肝癌患者病程中CTCs数量的变化及其与患者AFP水平、TNM分期及早期复发(6个月内)等临床病理的关系,以进一步探讨CTCs检测在原发性肝癌临床诊治中的应用价值。方法:我们首先使用成像流式技术评估本实验室前期建立的oHSVI-hTERT-GFP检测方法是否能特异性捕获外周血中的肝癌细胞,随后选取2015年9月至2016年10月间在中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院腹部外科收集的60例原发性肝癌患者为研究对象。所有受检者分别在手术前、术后第7天及术后3个月采集外周血4ml;使用oHSVI-hTERT-GFP法检测患者外周血中的CTCs,分别分析术前、术后7天及术后3个月CTCs数量与患者AFP水平、肝硬化、乙肝表面抗原、肿瘤数目、肿瘤大小、TMN分期、分化程度、有无血管癌栓及有无复发(6个月内)等临床病理的关系;并对病程中不同临床病理特征患者的CTCs数量变化进行分析,以进一步探讨CTCs检测在原发性肝癌临床诊治中的应用价值。结果:成像流式细胞仪成功检测到肝癌患者术前外周血中CD45-/GFP+/GPC3+细胞。纳入的60例原发性肝癌患者全部参与术前CTCs检测,分别有42例和35例患者参与术后7天和术后3个月的CTCs检测,其中有34例患者同时接受了 3个不同时间点CTCs的检测。术前、术后7天和术后3个月CTCs检测阳性率分别为100%、100%和91.43%(32/35)。60例肝癌患者手术前外周血中CTCs数量与肿瘤数目及微血管栓塞显著相关,而手术后7天和手术后3个月外周血中的CTCs数量与各临床病理参数之间无显著相关。手术后第7天CTCs数量显著高于手术前,而手术后3个月CTCs数量则显著低于手术后第7天的CTCs数量,但是与手术前无显著差异。不同的TNM分期,CTCs数量随时间的变化模式也不尽相同,随着病程的推移Ⅲ+Ⅳ期患者外周血CTCs数量呈逐渐升高的趋势。结论:(1)手术前外周血中CTCs数量与原发性肝癌患者肿瘤数目及微血管栓塞显著相关。(2)在肝癌病程发展中,Ⅲ+Ⅳ期患者外周血CTCs数量呈逐渐升高的趋势。