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不同植物对逆境胁迫具有不同的耐受性,不同的耐受性产生于进化过程中形成的基因应激调控机制。克隆和研究抗逆性基因对于我们了解植物的抗逆机制和改良植物品种具有重要的意义。枣树(Ziziphus jujuba Mill)原产于我国黄河流域,它耐寒,抗旱,抵御各种外界不良因子的能力强,尤其是对土壤瘠薄、干旱的忍耐力显著优于其它农作物。因此,枣树的抗逆性基因是非常宝贵的遗传资源,为了挖掘和研究枣树有关抗逆基因,本研究以山西省十大名枣品种之一的“壶瓶枣”为试材,从其结果枝cDNA文库中筛选并克隆获得了抗坏血酸过氧化物酶基因,对该基因的序列进行了生物信息学分析,构建了植物表达载体,并进行了相关表达研究及功能验证。 (1)枣树抗坏血酸过氧化物酶基因(ZjAPX)的序列分析:从枣树结果枝cDNA文库中筛选获得了一个抗坏血酸过氧化物酶基因,用生物信息学软件对该基因cDNA序列进行分析,分析结果表明此序列全长为753bp,编码251个氨基酸,分子量为62.55KD,理论等电点为5.10,不稳定指数为57.06,是一类不稳定蛋白,脂肪族系数为24.83,G+C含量为51%;该基因编码的蛋白没有高度保守的结构域,仅有2个低复杂度区域,该蛋白属于一个典型的植物亚铁血红素过氧化物酶家族蛋白,序列中包含一个过氧化物酶的活性部位“APimLRLaWHSA”和一个过氧化物酶亚铁血红素配体信号“DIVALSGGHTL”。该序列与已知的其它植物的APX的核苷酸同源性在77%~84%之间,氨基酸同源性在79%~92%之间,故将其命名为ZjAPX(DDBJ/EMBL/GenBank的注册号为:AB608053),它与大豆的APX(1oafA)有相似的三维结构。 (2)枣树抗坏血酸过氧化物酶基因(ZjAPX)植物表达载体的构建与转化拟南芥的研究:根据已获得的枣树抗坏血酸过氧化物酶基因ZjAPX的cDNA序列设计并合成特异性引物,PCR扩增出ZjAPX基因片段,并将其构建于植物表达载体PEZR(K)-LNY。冻融法将植物表达载体PEZR(K)-LNY-ZjAPX转入根癌农杆菌LBA4404,获得工程菌PEZR(K)-LNY-ZjAPX-L;工程菌株转化拟南芥,经过筛选获得了24株转ZjAPX基因的拟南芥植株。 (3)枣树抗坏血酸过氧化物酶基因(ZjAPX)在拟南芥体内的表达:通过对筛选获得的拟南芥植株进行鉴定,发现有部分植株不是转ZjApX基因植株。收获经鉴定为转基因植株的拟南芥种子,并对其种子在萌发期和生长期分别进行处理,结果显示:在相同的胁迫条件下转ZjAPX基因的拟南芥种子在萌发期的存活率较野生型高,且萌发后幼苗的根系也比野生型发达,转ZjAPX基因的拟南芥植株均具有比野生型植株较强的耐盐和干旱胁迫的能力。另外收集处理过的转基因拟南芥植株的叶片,并利用荧光定量分析,结果表明:转基因株系3和11能够很好地抵御盐胁迫环境,株系8和9的对照处理中ZjAPX的基因表达量很高,进一步说明转基因成功。 (4)枣树抗坏血酸过氧化物酶基因(ZjAPX)在枣树组织培养苗体内的表达:对辣椒枣组培苗继代和生根培养后,选取长势较好、基本一致的生根幼苗进行干旱、NaCl胁迫。采集在不同浓度、不同时间内NaCl和干旱(PEG)胁迫后的枣苗,采后立即用液氮速冻,然后分别提取各个样品的RNA,检测RNA合格后,进行反转录,并将反转录产物作为模板进行荧光定量PCR。定量RT-PCR结果表明,在50mM、100mM、200mM NaCl的胁迫下,ZjAPX基因的表达量呈先升高后降低的趋势,均在6h时表达量最大,300mM NaCl胁迫时,在3h时表达量最大;在PEG的胁迫下,ZjAPX基因的表达量均表现出先降低后升高的趋势,0.5MPa处理时,24h表达量最大,0.8MPa和1.2MPa处理均是在7h时表达量最大;此结果说明该基因的表达受一定的环境胁迫影响。