论文部分内容阅读
目的:在体外初步探讨石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水4种不同极性溶剂从广西鸡骨草中分离出的提取物对SGC-7901胃癌细胞、BEL-7404肝癌细胞、MCF-7乳腺癌细胞增殖的抑制作用,从而筛选出体外具有抑制肿瘤细胞增殖活性的鸡骨草提取物。在体内对鸡骨草提取物进行安全性评价。建立SGC-7901、BEL-7404、MCF-7细胞裸鼠皮下移植瘤模型,观察鸡骨草提取物体内抗肿瘤作用,结合体外抗肿瘤活性的筛选结果,从而筛选出鸡骨草体内外均具有抗肿瘤作用的提取物,为进一步分离鸡骨草抗肿瘤活性的单体化合物及其抗肿瘤作用机制提供实验基础。方法:（1）以SGC-7901、BEL-7404、MCF-7细胞为细胞模型,采用CCK-8法及观察细胞的形态来检测鸡骨草提取物对肿瘤细胞增殖的抑制作用。（2）采用hoechst33258荧光染色法观察细胞凋亡;采用流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期;（3）通过急性毒性试验对鸡骨草提取物的体内安全性进行评价;（4）建立SGC-7901、BEL-7404、MCF-7细胞裸鼠皮下移植瘤模型,观察鸡骨草提取物对SGC-7901、BEL-7404、MCF-7细胞裸鼠皮下移植瘤的抑瘤效果,采用苏木精—伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色法观察肿瘤组织的病理形态学变化,采用免疫组化法观察肿瘤组织中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达。结果:（1）CCK-8法的结果表明鸡骨草石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水提取物对SGC-7901、BEL-7404、MCF-7细胞增殖均有抑制作用且成剂量依赖性。除石油醚提取物外,另三种溶剂的提取物在药物浓度为0.7 mg/m L左右时,细胞抑制率均达50%以上,其中鸡骨草乙酸乙酯提取物体外抗肿瘤作用最强;（2）Hoechst 33258荧光染色法和Annexin V-FITC/PI双染法结果显示鸡骨草乙酸乙酯提取物处理BEL-7404细胞24 h后能有效诱导BEL-7404细胞凋亡（P<0.05）,且随药物浓度的增加,凋亡细胞明显增多;PI单染法检测细胞周期结果显示,不同浓度的鸡骨草乙酸乙酯提取物处理BEL-7404细胞24 h后,与空白对照组比较,给药组表现为G0/G1期细胞比例显著升高,S期和G2/M期细胞比例降低,其中鸡骨草乙酸乙酯提取物各浓度组的G0/G1期、S期、G2/M期与空白对照组比较,差异有统计学意义（P<0.05）;（3）急性毒性试验结果表明,与对照组相比,给药组小鼠的体重变化无统计学意义（P>0.05）,小鼠无任何中毒症状、无死亡情况,解剖后小鼠主要脏器的外形颜色,大小比例没有发现明显的异常改变,鸡骨草乙酸乙酯、正丁醇、水提取物对小鼠的半数致死量(median lethal dose,LD50)分别大于16080、27600、35360 mg/kg,根据急性毒性剂量分级标准表数值可判定CAE、NBE、WE无毒,表明鸡骨草乙酸乙酯、正丁醇、水提取物对小鼠无急性毒性作用。（4）体内实验结果表明鸡骨草乙酸乙酯、正丁醇、水提取物均表现出抗肿瘤效果,随着提取物给药剂量的增加抑瘤效果越明显。其中鸡骨草乙酸乙酯提取物体内抑瘤效果最强,对SGC-7901、BEL-7404、MCF-7细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑瘤率分别为43.64%、47.35%、29.53%;HE染色结果显示,3种肿瘤细胞的模型组肿瘤组织中癌细胞排列紧密,生长旺盛,细胞核大;鸡骨草乙酸乙酯、正丁醇、水提取物各给药组的肿瘤组织呈现不同程度的细胞坏死、核溶解、消失、肿瘤细胞大小不一,胞间疏松,细胞核较小,胞浆部分破裂,不完整,肿瘤细胞数目明显减少。以鸡骨草乙酸乙酯提取物高剂量组肿瘤组织坏死最明显。免疫组化检测结果显示,鸡骨草乙酸乙酯提取物中、高剂量组肿瘤组织中Bax积分光密度值均高于模型组,Bcl-2积分光密度值低于模型组,差别有统计学意义（P<0.01）,鸡骨草乙酸乙酯提取物低剂量组肿瘤组织中Bax、Bcl-2积分光密度值与模型组比较,差别无统计学意义（P>0.05）。结论:（1）鸡骨草提取物体外抑制肿瘤细胞增殖的活性大小为:乙酸乙酯提取物>正丁醇提取物>水提取物>石油醚提取物;（2）鸡骨草乙酸乙酯提取物具有诱导BEL-7404细胞凋亡和阻滞细胞周期于G0/G1的作用;（3）急性毒性试验结果表明,鸡骨草乙酸乙酯、正丁醇、水提取物对小鼠无急性毒性作用;（4）鸡骨草乙酸乙酯、正丁醇、水提取物对SGC-7901、BEL-7404、MCF-7细胞裸鼠皮下移植瘤有抑制作用,并且能诱导细胞凋亡。鸡骨草乙酸乙酯提取物能上调Bax蛋白和下调Bcl-2蛋白的表达。