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背景与目的癫痫是一种复杂的神经系统疾病,以神经元过度兴奋和突然的、异常同步放电为特征。癫痫发作严重影响患者的生活质量,给人类健康带来严重威胁。至今为止,癫痫仍然是一个重大的社会问题和全球财政负担。近期研究表明在癫痫发作的病理过程中,线粒体结构及功能受损,细胞内氧化应激水平升高、钙超载、细胞色素C释放增加,导致细胞凋亡。FUNDC1作为能在哺乳动物细胞中介导线粒体自噬的线粒体外膜蛋白,是一种新型线粒体自噬受体。神经元中,线粒体可以根据特定的代谢需求进行定位,这些需求在癫痫发作活动期间会增加。由于氧化呼吸链在线粒体内产生活性氧,最终可能导致线粒体结构和功能损伤。因此,细胞需要通过清除活性氧、DNA修复和蛋白质折叠和线粒体自噬等多种途径来进行线粒体质量控制。线粒体自噬是自噬的一种选择性形式,通过清除损伤的或积累的线粒体来维持线粒体的正常功能,在线粒体质量控制中有十分重要的作用。FUNDC1通过与LC3结合,促进线粒体自噬的激活,从而清除损伤的线粒体。目前为止,FUNDC1是否参与癫痫病程发展,是否具有神经保护作用,仍需进一步研究明确。本研究使用体外培养SD大鼠海马神经元,通过转染慢病毒干预FUNDC1表达,无镁诱导构建体外癫痫模型,镜下观察海马神经元的形态,检测神经元细胞自噬、氧化应激及凋亡指标,探讨FUNDC1调控的线粒体自噬是否在癫痫的神经损伤过程中发挥作用。方法取Sprague-Dawley胎鼠,用75%乙醇麻醉,在冰上迅速取出大脑,掀开大脑皮层,小心剥离双侧海马,剥离海马表面血管膜,剪碎之后进行消化、重悬,制成单细胞悬液,在体外进行原代神经元的培养。在培养第5天使用慢病毒转染FUNDC1,分为五组:对照组（CON）、无镁致痫组（AE）、无镁致痫+空载体组（AE+LV）、无镁致痫+过表达FUNDC1组（AE+LV-FUNDC1）及无镁致痫+敲除FUNDC1组（AE+LV-FUNDC1-shRNA）,在第7天进行神经元纯度鉴定,培养至第9天进行无镁细胞外液诱导,对照组使用正常细胞外液,之后用维持培养基培养24 h。镜下观察各组海马神经元的形态,采用NES染色法鉴定海马神经元的纯度,CCK8法检测细胞活力,QPCR法检测FUNDC1、LC3A/B表达,TMRE法、TUNEL染色法检测细胞凋亡,细胞免疫荧光法观察FUNDC1及自噬相关蛋白LC3B的表达,DHE法检测细胞内氧化应激水平。结果1.细胞形态学 培养第7天,在倒置显微镜下观察到神经元细胞呈现胞体丰满的状态,胞体周围的光晕明显,神经元之间有典型的轴突、树突,细胞间形成紧密连接。2.神经元纯度检测 采用NSE法染色,随机选取10个视野在荧光显微镜下观察并计数,取均数计算得神经元纯度为90%以上。3.FUNDC1对无镁外液海马神经元凋亡的影响 采用TMRE法与TUNEL法检测细胞凋亡。AE组神经元凋亡明显增加,与AE组相比,过表达FUNDC1组神经元凋亡明显减少,敲除FUNDC1组神经元凋亡增加,差异均有统计学意义（P＜0.05）;AE组与阴性对照组比较,两组间无统计学意义（P＞0.05）。4.FUNDC1对无镁外液致痫神经元线粒体自噬的作用 QPCR中,与CON组相比,AE组中FUNDC1与LC3A/B增加;与AE组相比,过表达FUNDC1组LC3A/B明显增加,敲除FUNDC1组LC3A/B减少,差异均有统计学意义（P＜0.05）;AE组与阴性对照组比较,两组间无统计学意义（P＞0.05）。5.FUNDC1对无镁外液致痫神经元线粒体自噬相关蛋白的作用 细胞免疫荧光中,与CON组相比,AE组中LC3B增加;与AE组相比,过表达FUNDC1组LC3B明显增加,敲除FUNDC1组LC3B减少,差异均有统计学意义（P＜0.05）;AE组与阴性对照组比较,两组间无统计学意义（P＞0.05）。6.FUNDC1对无镁外液致痫神经元氧化应激的作用 DHE法中,与CON组相比,AE组中细胞内ROS水平增加;与AE组相比,过表达FUNDC1组细胞内ROS水平明显减少,敲除FUNDC1组则增加,差异均有统计学意义（P＜0.05）;AE组与阴性对照组比较,两组间无统计学意义（P＞0.05）。结论1.在无镁致痫的大鼠海马神经元中,FUNDC1与LC3表达增加,提示癫痫发作过程中存在线粒体自噬,FUNDC1调控的线粒体自噬功能可能参与了癫痫的病理机制。2.FUNDC1可能通过促进线粒体自噬,减少线粒体氧化应激,抑制凋亡途径,从而保护海马神经元。