第一部分多囊卵巢综合征患者内分泌和糖代谢的临床资料分析背景：多囊卵巢综合征(PCOS)是一种病因复杂、临床表现异质性的疾病,以慢性无排卵、雄激素增高和超声下卵巢多囊样改变为基本特征,常伴随高胰岛素血症、胰岛素抵抗(IR)和糖脂代谢异常,在一定程度上与2型糖尿病(T2DM)有类似的临床表现和病理学特征。随年龄增长,PCOS患者糖脂代谢异常更加明显、发病率升高。PCOS重要的临床表现之一是肥胖,且以腹型肥胖为主,这不仅在PCOS发病机制中有一定作用,而且也是IR、T2DM的危险因素。但是,已有的研究发现,除肥胖以外,体重正常的PCOS患者与正常妇女相比仍然有较高的IR发生率。对PCOS患者IR影响因素的相关分析显示无论肥胖与否,IR均与睾酮水平密切相关。目的：本研究将20-40岁、体重指数匹配的PCOS患者按照是否有高雄激素血症进行分组,比较中国汉族高雄激素血症和非高雄激素血症PCOS患者内分泌、葡萄糖及胰岛素的代谢特征,为进一步深入研究PCOS患者糖代谢异常提供初步的理论依据。方法：按照鹿特丹诊断标准,选择2008年9月至2011年10月在山东大学附属生殖医院就诊的PCOS患者3342例,按是否有高雄激素血症分组后进行内分泌和葡萄糖代谢相关指标的分析。结果：1.在3342例PCOS患者中雄激素水平正常(T<60ng/d1)者1680人,占50.27%；高雄激素血症(T≥60ng/d1)者1662人,占49.73%。2. PCOS患者高雄组血清FSH、LH和E2均高于非高雄组,差别具有统计学意义(P<0.05)；体重指数(BMI)、腰臀比和泌乳素两组间差别没有统计学意义。3.空腹血糖(G0)两组间无差异,而在口服糖耐量试验(OGTT)中,高雄组各时点血糖均高于非高雄组,差别有统计学意义(p<0.05)；高雄组餐后120min(INS120)、180min (INS180)胰岛素水平均高于非高雄组,差异具有显著性(P<0.05)。4.高雄组患者糖负荷后30min胰岛素增值与葡萄糖增值的比值(△I30/△G30)、β-细胞功能修正指数(MBCI)及葡萄糖处置指数(DI)均低于非高雄组,差别有统计学意义(P<0.05)；空腹胰岛素敏感指数(ISI)和HOMA-β两组间差别没有统计学意义(P>0.05)。5.高雄组糖代谢异常发生率高于非高雄组,差别有统计学意义(P<0.05)。结论：PCOS患者高雄组较非高雄组有更明显的内分泌和糖代谢异常。PCOS患者高雄组胰岛β-细胞分泌功能和对葡萄糖的处理能力较非高雄者减弱。第二部分睾酮对INS-1细胞胰岛素基因表达和分泌的调节作用背景：多囊卵巢综合征(PCOS)患者中常发现高胰岛素血症和雄激素增高并存,且有研究证实高雄激素血症和高胰岛素血症(胰岛素抵抗/糖耐量异常)密切相关。胰岛素抵抗(IR)是2型糖尿病(T2DM)发病的重要机制之一。PCOS患者的IR发病率高达70-80%,且部分患者最终发展为T2DM。因此,有必要对胰岛素分泌缺陷的原因进行深入研究。越来越多的证据表明,当胰岛β-细胞功能正常时,机体不会出现糖代谢异常。当外周组织出现IR时,胰岛β-细胞首先代偿性增生、分泌胰岛素增加,维持正常血糖浓度。当刺激因素持续存在时,β-细胞处于长期应激环境中导致胰岛素分泌耗竭,胰岛素分泌量绝对和(或)相对不足,不能维持正常血糖浓度,进而导致T2DM发生。胰/十二指肠同源盒(PDX-1)基因对早期胰腺器官的发生、发育、调节胰岛素基因表达及GSIS有重要作用。PDX-1能促进胰岛素基因转录,并活化一系列参与维持p-细胞功能和细胞生存有关的基因。Johnson等发现PDX-1部分缺陷引起β-细胞凋亡增加、胰岛素分泌缺陷和糖尿病。葡萄糖转运子-2(Glut-2)是位于胰岛p-细胞表面的跨膜蛋白,主要负责将葡萄糖转运进入细胞,葡萄糖经Glut-2转运至线粒体启动三羧酸循环,促进胰岛素分泌。PDX-1通过活化葡萄糖激酶(GCK)和Glut-2调节葡萄糖转运及β-细胞胰岛素分泌。MAPKs是高度保守的细胞外信号传递分子,与炎症、肿瘤、肥胖和糖尿病的发生密切相关。ERK1/2被认为是经典MAPKs家族成员,它的活化参与葡萄糖刺激后胰岛素基因的表达。阻断ERK1/2的活性可阻止葡萄糖刺激后胰岛素启动子活化。葡萄糖诱导的胰岛素分泌反应依赖于ERK1/2活化的PDX-1、Beta2及E2A基因产物杂合体(E12和E47)在内的一系列转录因子。MAPKs是雄激素受体的下游信号分子,睾酮是否可通过雄激素受体(AR)激活ERK1/2通路调节胰岛素分泌有待进一步探讨。目的：研究睾酮对INS-1细胞胰岛素相关基因表达和分泌的影响及机制。具体探讨以下问题：1.睾酮对INS-1细胞胰岛素相关基因表达和分泌的影响；2.睾酮是否通过经典的AR/ERK1/2/PDX-1信号通路发挥调控作用。方法：1.将大鼠胰岛细胞系INS-1细胞(30-45代)常规培养。细胞贴壁24h后,加入睾酮：分组一：睾酮终浓度达到1.7×10-10M、1.7×10-9M、1.7×10-8M、1.7×10-7M、1.7×10-6M,培养48h。分组二：1.7×10-7M睾酮培养1-5天。分组三：为验证睾酮是否通过雄激素受体通路发挥作用,细胞采用1×10-7M氟他胺(睾酮受体阻断剂)预处理半小时,后加入1.7×10-7M睾酮培养48h。2.葡萄糖刺激2h后取上清检测胰岛素分泌情况。RT-PCR检测INS-1细胞PDX-1、Glut-2以及胰岛素、AR的mRNA水平；Western blot检测PDX-1、Glut-2以及ERKl/2的蛋白表达水平,同时检测细胞匀浆中MDA含量。结果：1.INS-1细胞对GSIS的反应性从3.3mM葡萄糖(G3.3mM)开始,随葡萄糖浓度的增加,胰岛素分泌增加,当葡萄糖浓度达到16.7mM时,胰岛素分泌达高峰,胰岛素水平增加为基础状态的2.36倍(P<0.05)；因此在本实验中采用16.7mM葡萄糖浓度刺激INS-1细胞,分析胰岛素的释放情况。2.睾酮对INS-1细胞胰岛素释放的调节作用与无睾酮组相比,1.7×10-8M和1.7×10-7M睾酮培养可使INS-1细胞胰岛素分泌量分别增加至基础状态1.93倍(P<0.05)和1.74倍(P<0.05),而1.7×10-8M和1.7×10-7M睾酮组间比较差别没有统计学意义。1.7×10-6M睾酮培养后胰岛素分泌比1.7×10-8M组降低,差别有统计学意义(P<0.05),但仍高于对照组(P<0.05)。1.7×10"7M睾酮培养2天,INS-1细胞胰岛素分泌量是无睾酮组的1.45倍。随睾酮培养时间的延长,第3天和第4天胰岛素释放逐渐降低,与对照组相比胰岛素释放量仍然属于代偿状态(P>0.05)。睾酮作用第5天胰岛素释放量与对照组相比明显降低,细胞功能处于失代偿状态(P<0.05)。雄激素受体阻断剂-氟他胺,能够部分阻断睾酮处理的葡萄糖刺激引起的胰岛素分泌增加。3.睾酮对INS-1细胞胰岛素基因表达的影响及机制INS-1细胞中存在AR基因的表达,并且随睾酮浓度的增加,AR基因表达上调。睾酮与AR结合,呈浓度和时间依赖性调节胰岛素基因及胰岛素调节因子(PDX-1及Glut-2)的表达。实时定量RT-PCR结果显示1.7×10-7M睾酮培养48h能使胰岛素mRNA表达升高为无睾酮培养组的2倍(P<0.05)。1.7×10-6M睾酮较1.7×10-7M虽稍降低胰岛素mRNA的表达,但仍然高于对照组(P<0.05)。1.7×10-7M睾酮培养不同时间可先增加、后降低胰岛素基因表达。PDX-1和Glut-2mRNA表达趋势基本与胰岛素mRNA表达相似。Western blot结果显示随睾酮浓度的增加PDX-1、Glut-2蛋白表达增加,p-ERK1/2活化增强,而总ERK1/2表达无明显差异。睾酮浓度增加至1.7×10-6M可使上述蛋白表达降低；1.7×10-7M睾酮连续处理,则观察到从第3天开始PDX-1、Glut-2蛋白表达降低,ERK1/2磷酸化降低,提示睾酮对INS-1细胞的功能调控存在时量和剂量效应。睾酮培养可增加INS-1细胞MDA的含量,睾酮受体阻断剂-氟他胺预处理INS-1细胞,可部分阻断1.7×10-7M睾酮培养48h所引起ERK1/2磷酸化及MDA含量增加。结论：睾酮通过AR/ERK1/2/PDX-1信号通路影响INS-1细胞胰岛素基因的表达及分泌。该信号通路可能参与PCOS患者糖代谢异常的发生、发展。第三部分内质网应激参与睾酮对INS-1细胞的损伤作用背景：内质网是细胞内蛋白质合成、折叠及Ca2+储存的主要场所,在细胞内具有重要的生理功能。多种细胞应激,包括缺血、低氧、蛋白合成增加和过氧化损伤等均可触发内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)。适当激活未折叠蛋白反应、提高蛋白质折叠能力、具有细胞保护作用,但持续或严重的ERS可诱发细胞凋亡程序。在生理情况下,内质网通过氧化新生多肽链中半胱氨酸残基形成二硫键而对蛋白进行修饰,此过程中可形成活性氧(ROS),而生成的ROS再由谷胱甘肽(GSH)等抗氧化防御机制所清除。ERS时内质网负荷加重,ROS生成过多超过抗氧化防御能力导致氧化应激。同时,氧化应激又通过破坏内质网Ca2+稳态和影响内质网伴侣分子等诱发ERS的产生。内质网是细胞凋亡调节中的重要环节。多囊卵巢综合症(PCOS)患者体内高雄激素血症常伴随胰岛素分泌增加和2型糖尿病(T2DM)的产生,提示睾酮产生增加与胰岛β-细胞损害之间存在密切联系。睾酮分泌增多可诱导胰岛β-细胞蛋白合成增加和过氧化损伤,进而引起β-细胞损害。Medina MC的研究发现,DHEA可以增加成年大鼠β-细胞体积、促进GSIS。睾酮过量可诱发氧化应激引起β-细胞凋亡。雄激素/雄激素受体信号通路可通过内质网应激途径损害肝细胞,造成肝细胞凋亡。胰腺和肝脏同属内分泌腺体,且β-细胞具有高度发达的内质网系统,对ERS极其敏感。那么雄激素是否通过内质网应激造成β-细胞凋亡?目的：目前睾酮对胰岛细胞的作用多集中在其对胰岛素分泌的研究,对细胞增殖、凋亡及细胞损伤的研究甚少。本实验通过体外实验观察不同浓度的睾酮、睾酮作用不同时间对INS-1细胞凋亡的影响,探讨ERS通路与INS-1细胞凋亡的关系。方法：1.将大鼠胰岛细胞系INS-1细胞(30-45代)常规培养。细胞贴壁24h后,加入睾酮：分组一：睾酮终浓度达到1.7×10-0M、1.7×10-9M、1.7×10-8M、1.7×10-7M,培养48h。分组二：1.7×10-7M睾酮培养12h-72h。分组三：为验证睾酮是否通过经典的雄激素受体通路发挥作用,细胞采用1×10-7M氟他胺(睾酮受体阻断剂)预处理半小时后,加入1.7×10-7M睾酮培养48h。2.MTT检测细胞增殖；流式细胞仪及荧光检测细胞凋亡及细胞周期。电镜观察INS-1细胞主要细胞器的形态学变化。RT-PCR检测INS-1细胞内质网应激通路基因Bip、ATF4、CHOP、SERCA2b和Bax的mRNA水平；Western blot检测Bip、p-eIF2α、ATF4和CHOP蛋白表达水平。结果：1.睾酮对INS-1细胞增殖、凋亡的影响：MTT结果显示随睾酮浓度增加和作用时间延长,INS-1细胞活力降低,细胞增殖能力减弱；流式细胞计数及荧光结果显示睾酮可呈时量和剂量依赖方式诱导INS-1细胞凋亡。1.7×10-7M睾酮培养48h和72h可使INS-1细胞凋亡率增加至对照组2.83倍和3.62倍(P<0.05)。1×10-7M氟他胺可部分阻断1.7×10-7M睾酮培养48h诱导的INS-1细胞凋亡。2.睾酮对INS-1细胞周期的影响：1.7×10-7M睾酮培养INS-1细胞24h和48h均可促进细胞增殖,表现为S、G2/M期细胞比例增加；但72h后细胞增殖能力较48h开始减弱。3.电镜下INS-1细胞主要细胞器的形态学观察：INS-1细胞胞体为圆形,由胞体伸出若干小的突起,胞核类圆形,核内染色质分散,电子密度低,胞浆内含大量粗面内质网；1.7×10-7M睾酮作用48h后,部分INS-1细胞出现体积减小,细胞核固缩,电子密度增高,粗面内质网池扩张、断裂。4.睾酮对INS-1细胞凋亡的机制研究：RT-PCR结果显示随睾酮浓度的增加和作用时间延长,INS-1细胞Bip、ATF4、CHOP和Bax基因增加,SERCA2bmRNA在不同睾酮浓度组间差别不大,但随睾酮培养时间延长而降低。Western blot显示睾酮可增加INS-1细胞Bip、p-eIF2α、CHOP蛋白表达,说明睾酮可能活化ERS通路。氟他胺可部分阻断睾酮引起的CHOP表达增高。结论：睾酮可通过p-eIF2α/ATF4/CHOP信号通路诱导INS-1细胞凋亡。