论文部分内容阅读
目的:开发一种兼具抗炎、促进软骨修复及生物安全的多功能生物材料是治疗退行性骨关节炎（又称骨关节炎）的新思路和有效途径;而目前,无论是研究还是临床上均无这类材料或药物的应用。研究报道,陆生动物来源的II型胶原具有促进正常软骨细胞分泌软骨基质、参与透明软骨修复的功能,但其能否在骨关节炎环境下发挥该功能仍是个挑战。另外,由于陆生动物来源的II型胶原被认为与人类关节软骨中的II型胶原有相同的免疫表位,易引起机体产生免疫反应,所以通常不适合用于骨关节炎的治疗。在胶原的抗炎方面,尽管本课题组前期研究已经发现I型水解胶原中的某些氨基酸成分具有一定的抗炎功效,但具有三螺旋结构的II型胶原是否具有抗炎效应却并不清楚。据此,本研究将从资源丰富、价格低廉、生物安全性更高的海洋生物入手,开发一种全新的、无免疫原性的海洋II型胶原（marine type II collagen,MCII）,研究MCII对巨噬细胞趋化及炎症行为的影响及机制,探讨其对软骨细胞异常凋亡和肥大样变的抑制效应和机制,阐明MCII免疫调控巨噬细胞促进软骨修复的生物新功能,最终通过大鼠骨关节炎模型,全面验证MCII体内缓解骨关节炎的效果,为骨关节炎的治疗提供新思路和新材料。材料和方法:（1）通过酶法提取MCII,采用氨基酸分析、分子量检测等手段进行表征。（2）设计体外与体内免疫原性实验,对比分析MCII与牛II型胶原所引起的细胞免疫和体液免疫反应,探讨其生物安全性。（3）应用transwell模型,研究在MCII作用下M0型巨噬细胞的趋化行为;采用M1型巨噬细胞炎症模型,探讨MCII对M1型巨噬细胞分泌致炎因子功能变化和机制。（4）选用原代小鼠关节软骨细胞（murine articular chondrocyte,MAC）构建凋亡模型,研究MCII对MAC凋亡率的影响及其作用机制。（5）分别设计直接接种和巨噬细胞条件培养2种模型,探讨MCII直接和通过调控巨噬细胞炎症反应对MAC肥大样变的影响;同时,分析MCII对巨噬细胞M2表型的活化,以及其对MAC分泌软骨基质的间接调控作用。（6）构建大鼠骨关节炎模型,分别采用组织病理学和生化检查的手段,分析软骨结构完整性和软骨基质成分GAG的含量、软骨细胞凋亡和MMP-13分泌情况、滑膜炎症反应程度、M2型巨噬细胞活化水平、关节液中致炎因子以及促成软骨因子的水平,全面研究MCII对骨关节炎的体内缓解效果及相关机制。结果:（1）提取的MCII含18种氨基酸,每条肽链分子量为110 k Da左右。（2）相比牛II型胶原,MCII无明显的免疫原性。（3）MCII显著抑制M0型巨噬细胞的趋化运动;其通过上调M1型巨噬细胞中磷酸酯酶TCPTP的活性促使p-STAT1去磷酸化,降低M1型巨噬细胞表达致炎因子NO、IL-1β及TNF-α的水平。（4）MCII通过激活MAC表面的甘氨酸受体（Gly R）,降低细胞内的Ca2+浓度,使凋亡相关因子Bax表达水平下调、Bcl-2表达水平上调,并抑制Cyt C从线粒体中释放和Caspase-3活化,发挥抑制低浓度SNP（50μM）对MAC凋亡的刺激效应。（5）MCII既能直接抑制肥大样变MAC中p-p65信号的磷酸化,降低MAC表达MMP-13的水平,又能通过抑制M1型巨噬细胞炎症反应防止正常MAC的肥大样变和分泌MMP-13。此外,MCII既能直接作用于MAC提高其分泌软骨基质Col II、GAG的水平,又能通过诱导M2型巨噬细胞的活化、表达TGF-β、IGF生长因子,间接提高MAC分泌软骨基质的能力。（6）MCII能在一定程度上提高骨关节炎大鼠病损软骨表面的完整性以及软骨基质糖胺聚糖的含量,显著减少软骨细胞凋亡及肥大样变水平,降低滑膜组织增生及炎细胞浸润程度,诱导M2型巨噬细胞活化,增加关节液中TGF-β水平并减少IL-1β、TNF-α的水平,最终有效缓解大鼠骨关节炎。结论:（1）首次成功制备了一种新型MCII,该胶原被证明无免疫原性,具有比陆生动物II型胶原更优异的生物安全性;（2）揭示MCII具有抑制M0型巨噬细胞趋化富集的功能,阐明MCII可以通过提高M1型巨噬细胞中TCPTP活性来抑制p-STAT1炎症信号从而发挥抗炎作用,提示MCII能降低局部炎症水平并阻止炎症反应的放大;（3）揭示MCII可以通过激活MAC表面的Gly R来下调细胞内Ca2+浓度,发挥抑制MAC凋亡和肥大样变的效应,说明MCII可以减轻软骨细胞的损伤,有利于软骨的修复;（4）首次发现MCII能通过免疫调控M2型巨噬细胞的活化和促成软骨因子TGF-β、IGF的表达来促进MAC分泌软骨基质而利于软骨修复。（5）MCII既能通过减少骨关节炎大鼠滑膜巨噬细胞的浸润和抑制炎症反应来降低关节液中IL-1β等致炎因子水平,又能通过降低关节软骨细胞分泌MMP-13水平、抑制软骨细胞凋亡、诱导M2型巨噬细胞活化和分泌促成软骨因子TGF-β增加关节软骨中GAG含量,最终在动物体内表现出显著的缓解骨关节炎的效应。本研究为MCII用于骨关节炎的治疗提供了重要的科学依据。