目的赖氨酸残基乙酰化已经成为蛋白质翻译后修饰的重要过程之一,参与了体内包括肿瘤在内多种疾病的发生发展。因此,调控蛋白乙酰化修饰水平关键酶的异常表达在肿瘤进展中具有重要作用。赖氨酸乙酰化修饰由乙酰转移酶(HATs)和去乙酰化酶(HDACs)共同调控,越来越多证据表明HDACs家族成员与肿瘤发展密切相关。HDAC6作为HDACs家族中唯一一个具有两个去乙酰化酶活性结构域成员,通过调控α微管蛋白(α-tubulin)以及皮层肌动蛋白(cortactin)乙酰化水平发挥调控细胞迁移侵袭的重要作用。HDAC6酶活性结构域的特性决定其靶向修饰底物的广泛性,对于HDAC6内源性靶标的鉴定有助于拓展我们对HDAC6在肿瘤生物学行为中的认知。本研究旨在探讨HDAC6在结肠癌生物学行为尤其是肿瘤转移中的分子机制,为临床探究新结肠癌转移治疗靶点提供有力的理论依据。方法1.利用GEO结肠癌相关数据库分析HDAC6在结肠肿瘤中表达特点。2.免疫组化染色本院121例结肠癌病人标本,分析HDAC6表达情况与病人年龄、性别、分化程度、原发组织浸润深度、淋巴结转移及远处转移病理参数之间相关性。3.细胞水平降低HDAC6表达以及抑制HDAC6去乙酰化酶活性:WST检测对细胞增殖活力的影响,流式以及免疫印迹检测对细胞凋亡的影响,Transwell检测对细胞迁移侵袭能力的影响,划痕实验检测对细胞损伤修复能力的影响。4.动物水平分析敲降HDAC6对人结肠癌细胞裸鼠皮下成瘤以及经脾肝转移能力的影响。5.非标记定量蛋白质乙酰化修饰组学鉴定HDAC6新型靶向修饰底物。筛选差异表达乙酰化肽段对应蛋白,进行聚类分析、生物学功能注释,明确HDAC6潜在靶向修饰底物的细胞定位、所参与的生物学过程以及分子功能。6.通过对差异蛋白乙酰化修饰位点所在结构域及在物种进化中保守性分析,我们重点研究AKAP12,分析HDAC6去乙酰化AKAP12分子机制。免疫共沉淀分析AKAP12与HDAC6之间有无相互作用;免疫沉淀确定HDAC6是否为AKAP12去乙酰化酶。7.探讨HDAC6去乙酰化AKAP12生物学意义。Real-time PCR及western blot分析HDAC6与AKAP12在基因与蛋白表达水平相关性;应用CHX以及MG132明确HDAC6对AKAP12蛋白稳定性的影响。在HDAC6敲降稳系中进一步敲低AKAP12,分析结肠癌细胞迁移侵袭能力变化。结果1.GEO数据分析显示HDAC6在伴远处转移结肠癌组织中表达明显高于不伴远处转移结肠癌组织;在肝转移灶中表达显著高于配对原发灶;然而,HDAC6表达水平在配对结肠癌组织及癌旁组织中无明显差异。我院结肠癌病人标本免疫组化结果显示:伴远处转移、淋巴结转移结肠癌组织中HDAC6表达水平要高于不伴上述转移情况结肠癌组织,HDAC6高表达与淋巴结转移、远处转移呈正相关,与患者年龄、性别、分化程度、原发肿瘤浸润深度(T分期)无明显相关性;在配对结肠癌组织及癌旁组织中表达无显著差异。2.在细胞水平,抑制HDAC6去乙酰化酶活性和敲降HDAC6表达可明显抑制结肠癌细胞迁移侵袭能力;细胞增殖活力、凋亡水平则无明显改变。3.在动物水平,降低HDAC6表达可显著降低结肠癌细胞经脾肝转移能力;对结肠癌细胞裸鼠皮下成瘤能力则无明显影响。4.非标记定量蛋白质乙酰化修饰组学结果显示,HDAC6潜在靶向修饰底物主要定位于细胞质,主要参与细胞运动、趋化、黏附等生物学过程,具有与蛋白质结合、蛋白激酶结合的分子功能。5.HDAC6与AKAP12之间具有相互作用,HDAC6可介导AKAP12去乙酰化修饰。6.敲降HDAC6以及抑制HDAC6去乙酰化酶活性可诱导AKAP12乙酰化水平上调,使其经UPS系统降解减少,蛋白稳定性增加。HDAC6表达水平以及去乙酰化酶活性对AKAP12基因水平无明显影响。在敲降HDAC6基础上进一步沉默AKAP12,结肠癌细胞迁移侵袭能力有所恢复。结论1.HDAC6高表达与结肠癌细胞迁移侵袭能力密切相关。2.AKAP12是HDAC6新型靶向修饰底物,HDAC6可通过降低AKAP12乙酰化水平,降低AKAP12蛋白稳定性进而促进结肠癌细胞的迁移侵袭能力。