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【目的】
1.明确溃疡性结肠炎(Ulcerativecolitis,UC)组织中NOD样受体家族基因表达谱及炎症小体激活差异。
2.了解肠细胞炎症模型中NOD样受体家族基因表达谱及炎症小体激活差异,探讨炎症小体的作用及作用机制。
【方法】
1.收集UC和正常结肠组织标本,qRT-PCR检测结肠组织中NOD样受体家族及细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-18和IL-33的mRNA表达。
2.利用LPS或TNF-α刺激HCT-116或NCM460建立肠细胞炎症模型。MTS法检测细胞活性;细胞荧光双标记染色观察细胞形态;qRT-PCR检测TNF-α、IL-1β和IL-18的表达,ELISA检测IL-1β、IL-18分泌;筛选出构建肠细胞炎症模型的最佳条件。在肠细胞炎症模型中,qRT-PCR检测NOD样受体家族基因的表达;免疫印迹(WB)检测NLRC4、NAIP、Caspase-1、IL-1β、IL-18和GSDMD表达。
3.通过siRNA转染沉默HCT116细胞中NLRC4炎症小体,qRT-PCR及WB检测沉默效率。利用20μg/LTNF-α刺激细胞后,qRT-PCR及WB检测IL-1β、IL-18的表达。
【结果】
1.UC组织中NOD样受体家族基因表达谱及炎症小体激活差异
与正常结肠组织组对比,UC组织中NLRP3、NLRC4、NLRP7转录水平均显著上调(P<0.05),NLRP5未见表达,其余NOD样受体家族基因表达差异均无统计学意义(P>0.05)。
2.UC组织中部分细胞因子的表达情况
与正常结肠组织组对比,UC组织中细胞因子TNF-α、IL-33转录水平均显著上调(P<0.05),IL-1β、IL-18转录水平差异均无统计学意义(P>0.05)。
3.成功构建肠细胞炎症模型
与对照组相比,TNF-α(20~40)μg/L显著抑制HCT116细胞增殖(P<0.05);荧光双标记染色观察细胞形态结果显示:与对照组相比,20μg/LTNF-α处理HCT116细胞后,胞核形态不均一,部分胞核膨胀变大、固缩,细胞微丝分布不均,细胞周围边界模糊,提示发生细胞焦亡/凋亡;qRT-PCR结果显示:与对照组相比,肠细胞炎症模型组(TNF-α处理48h)中IL-1β、IL-18、TNF-α的mRNA表达上调(P<0.05);ELISA实验结果显示:与对照组相比,TNF-α处理后48h,IL-1β分泌显著增加(P<0.05)。
4.肠细胞炎症模型中NOD样受体家族基因表达谱及炎症小体激活情况
与对照组相比,肠细胞炎症模型组中NLRA、NLRC4、NLRC5、NLRP8、NLRP12和NLRP10基因转录水平均显著上调(P<0.05),其余NOD样受体家族基因表达差异均无统计学意义(P>0.05);WB实验结果显示:与对照组相比,肠细胞炎症模型组中NLRC4、NAIP、Casp-1、IL-1β、IL-18表达差异无均统计学意义(P>0.05),而GSDMD表达显著上调(P<0.05)。
5.沉默NAIP及NLRC4后,肠细胞炎症小体及相关细胞因子表达情况
转染NLRC4-siRNA、NAIP-siRNA后,NLRC4、NAIP转录水平表达均下调(P<0.05),NAIP、NLRC4蛋白表达均无明显变化(P>0.05)。20μg/LTNF-α处理分别转染NLRC4-siRNA、NAIP-siRNA至HCT116细胞48h后,与NC-siRNA组相比,IL-1β、IL-18的转录水平和蛋白表达差异均无统计学意义(P>0.05)。
【结论】
1.NOD样受体家族中NLRP3、NLRC4、NLRP7在UC组织中表达上调,其与UC发病进程可能有关。
2.TNF-α、IL-33在活动期UC组织中表达增高,可能参与UC的炎症过程。
3.NLRC4炎症小体参与UC炎症的发生、发展过程,但可能与调控IL-1β、IL-18表达而发挥作用无关,可能存在其他机制。
1.明确溃疡性结肠炎(Ulcerativecolitis,UC)组织中NOD样受体家族基因表达谱及炎症小体激活差异。
2.了解肠细胞炎症模型中NOD样受体家族基因表达谱及炎症小体激活差异,探讨炎症小体的作用及作用机制。
【方法】
1.收集UC和正常结肠组织标本,qRT-PCR检测结肠组织中NOD样受体家族及细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-18和IL-33的mRNA表达。
2.利用LPS或TNF-α刺激HCT-116或NCM460建立肠细胞炎症模型。MTS法检测细胞活性;细胞荧光双标记染色观察细胞形态;qRT-PCR检测TNF-α、IL-1β和IL-18的表达,ELISA检测IL-1β、IL-18分泌;筛选出构建肠细胞炎症模型的最佳条件。在肠细胞炎症模型中,qRT-PCR检测NOD样受体家族基因的表达;免疫印迹(WB)检测NLRC4、NAIP、Caspase-1、IL-1β、IL-18和GSDMD表达。
3.通过siRNA转染沉默HCT116细胞中NLRC4炎症小体,qRT-PCR及WB检测沉默效率。利用20μg/LTNF-α刺激细胞后,qRT-PCR及WB检测IL-1β、IL-18的表达。
【结果】
1.UC组织中NOD样受体家族基因表达谱及炎症小体激活差异
与正常结肠组织组对比,UC组织中NLRP3、NLRC4、NLRP7转录水平均显著上调(P<0.05),NLRP5未见表达,其余NOD样受体家族基因表达差异均无统计学意义(P>0.05)。
2.UC组织中部分细胞因子的表达情况
与正常结肠组织组对比,UC组织中细胞因子TNF-α、IL-33转录水平均显著上调(P<0.05),IL-1β、IL-18转录水平差异均无统计学意义(P>0.05)。
3.成功构建肠细胞炎症模型
与对照组相比,TNF-α(20~40)μg/L显著抑制HCT116细胞增殖(P<0.05);荧光双标记染色观察细胞形态结果显示:与对照组相比,20μg/LTNF-α处理HCT116细胞后,胞核形态不均一,部分胞核膨胀变大、固缩,细胞微丝分布不均,细胞周围边界模糊,提示发生细胞焦亡/凋亡;qRT-PCR结果显示:与对照组相比,肠细胞炎症模型组(TNF-α处理48h)中IL-1β、IL-18、TNF-α的mRNA表达上调(P<0.05);ELISA实验结果显示:与对照组相比,TNF-α处理后48h,IL-1β分泌显著增加(P<0.05)。
4.肠细胞炎症模型中NOD样受体家族基因表达谱及炎症小体激活情况
与对照组相比,肠细胞炎症模型组中NLRA、NLRC4、NLRC5、NLRP8、NLRP12和NLRP10基因转录水平均显著上调(P<0.05),其余NOD样受体家族基因表达差异均无统计学意义(P>0.05);WB实验结果显示:与对照组相比,肠细胞炎症模型组中NLRC4、NAIP、Casp-1、IL-1β、IL-18表达差异无均统计学意义(P>0.05),而GSDMD表达显著上调(P<0.05)。
5.沉默NAIP及NLRC4后,肠细胞炎症小体及相关细胞因子表达情况
转染NLRC4-siRNA、NAIP-siRNA后,NLRC4、NAIP转录水平表达均下调(P<0.05),NAIP、NLRC4蛋白表达均无明显变化(P>0.05)。20μg/LTNF-α处理分别转染NLRC4-siRNA、NAIP-siRNA至HCT116细胞48h后,与NC-siRNA组相比,IL-1β、IL-18的转录水平和蛋白表达差异均无统计学意义(P>0.05)。
【结论】
1.NOD样受体家族中NLRP3、NLRC4、NLRP7在UC组织中表达上调,其与UC发病进程可能有关。
2.TNF-α、IL-33在活动期UC组织中表达增高,可能参与UC的炎症过程。
3.NLRC4炎症小体参与UC炎症的发生、发展过程,但可能与调控IL-1β、IL-18表达而发挥作用无关,可能存在其他机制。