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CFTR(Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator)是一种c AMP依赖的氯离子通道,在多种上皮组织、心脏、平滑肌、神经元、内皮细胞、精子和卵子中广泛表达。CFTR在包括气道、胃肠道、生殖道、汗腺和唾液腺的分泌和吸收中起着重要的作用。因此,CFTR功能的缺陷与疾病有关,包括分泌性腹泻、囊性纤维化(CF)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)等。近年来的研究发现,CFTR除了是一个离子通道,也是一个与癌症进程相关的多个信号通路的重要调节器,它的突变能增加胃肠道、胰腺等的患癌风险。研究表明,CFTR在非小细胞肺癌中的表达量低于正常肺组织,并且CFTR的低表达与非小细胞肺癌的进展和肿瘤的侵袭能力明显相关。因此,CFTR可能是肺癌患者预后、预测的生物标志物。在本研究中,利用qPCR、Western Blot、免疫细胞化学实验方法,比较CFTR在人正常支气管上皮细胞HBE、人支气管上皮细胞BEAS-2B、人支气管肺泡腺癌细胞NCI-H1650、人肺泡Ⅱ型腺癌细胞A549、人肺鳞癌细胞NCI-H226、人KRAS突变Ⅲ级表皮样肺癌细胞Calu-1中表达量的区别。利用免疫荧光实验方法,研究CFTR在肺癌细胞中的定位。利用三种CFTR抑制剂(CFTRinh-172、GlyH-101、BPO-27)和激活剂(Genistein、Forskolin、IBMX)作为工具药,通过细胞增殖、细胞凋亡、细胞划痕、细胞侵袭、Western Blot实验,研究CFTR的氯离子通道功能对上述不同类型的肺癌增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响及作用机制。主要研究结果如下:1.qPCR、Western Blot和免疫细胞化学实验结果显示,CFTR在以下几种细胞中的表达量从高到低依次为HBE、H1650、A549、Calu-1、H226、BEAS-2B。其中,CFTR在HBE中的表达量远高于人支气管上皮细胞BEAS-2B。CFTR在肺癌细胞中的表达量高于人支气管上皮细胞BEAS-2B。CFTR在肺腺癌细胞H1650和A549中的表达量高于肺鳞癌细胞H226。CFTR在支气管肺泡腺癌细胞H1650中的表达量高于肺泡Ⅱ型腺癌细胞A549。CFTR在KRAS突变的肺癌细胞Calu-1中的表达量低于未发生突变的肺腺癌细胞H1650和A549。2.免疫荧光实验结果显示,CFTR定位于肺癌细胞的细胞膜和细胞质,在细胞质中的定位较多。3.细胞毒性实验结果显示,CFTRinh-172的浓度小于100μM时,对H1650和H226无毒性;小于50μM时,对A549和Calu-1无毒性。GlyH-101的浓度小于50μM时,对Calu-1无毒性;小于25μM时,对H1650、A549和H226无毒性。BPO-27的浓度小于25 n M时,对H1650、Calu-1和H226无毒性;小于20 n M时,对A549无毒性。Genistein的浓度小于100μM时,对H1650和Calu-1无毒性;小于50μM时,对A549和H226无毒性。IBMX的浓度小于100μM时,对Calu-1无毒性;小于50μM时,对H1650、A549和H226无毒性。Forskolin的浓度小于100μM时,对H1650、A549、Calu-1和H226都无毒性。4.细胞增殖实验结果显示,CFTR抑制剂CFTRinh-172、GlyH-101和BPO-27能够促进H1650、A549、Calu-1、H226细胞的增殖。在H1650中,CFTRinh-172的最佳浓度为12.5μM,BPO-27的最佳浓度为12.5 n M。在A549中,CFTRinh-172的最佳浓度为3.125μM,GlyH-101的最佳浓度为1.5625μM,BPO-27的最佳浓度为6.25 n M。在Calu-1中,GlyH-101的最佳浓度为3.125μM,BPO-27的最佳浓度为3.125 n M。在H226中,CFTRinh-172的最佳浓度为12.5μM,GlyH-101的最佳浓度为1.5625μM,BPO-27的最佳浓度为12.5 n M。5.细胞增殖实验结果显示,CFTR激活剂Genistein、IBMX和Forskolin能够抑制H1650、A549、Calu-1、H226细胞的增殖。在H1650中,IBMX的最佳浓度为25μM,Forskolin的最佳浓度为25μM。在A549中,Genistein的最佳浓度为50μM,IBMX的最佳浓度为50μM,Forskolin的最佳浓度为25μM。在Calu-1中,Genistein的最佳浓度为50μM,IBMX的最佳浓度为50μM,Forskolin的最佳浓度为6.25μM。在H226中,Genistein的最佳浓度为50μM,Forskolin的最佳浓度为6.25μM。6.细胞凋亡实验结果显示,CFTR抑制剂能够抑制A549细胞的凋亡,CFTRinh-172效果最明显,CFTR激活剂中只有Genistein促进了A549的凋亡。7.细胞划痕实验结果显示,CFTR抑制剂CFTRinh-172、GlyH-101和BPO-27能够促进H1650、A549、Calu-1、H226细胞的迁移。在H1650中,CFTRinh-172的最佳浓度为10μM,GlyH-101的最佳浓度为5μM,BPO-27的最佳浓度为16 n M。在A549细胞中,BPO-27的最佳浓度为16 n M。在Calu-1中,CFTRinh-172的最佳浓度为10μM,GlyH-101的最佳浓度为5μM。H226中,CFTRinh-172的最佳浓度为10μM,GlyH-101的最佳浓度为5μM,BPO-27的最佳浓度为16 n M。8.细胞划痕实验结果显示,CFTR激活剂Genistein、IBMX和Forskolin能够抑制肺癌细胞H1650、A549、Calu-1、H226的迁移。在H1650、A549、Calu-1和H226中,Genistein和IBMX的最佳浓度均为50μM,Forskolin的最佳浓度均为20μM。9.细胞侵袭实验结果显示,CFTRinh-72和GlyH-101均能促进A549和H226的侵袭。Forskolin、Genistein和IBMX均能抑制A549和H226的侵袭。10.Western Blot实验结果显示,CFTRinh-172明显促进了细胞周期蛋白Cyclin D1、Cyclin E1和波形蛋白Vimentin的表达;Forskolin明显抑制了细胞周期蛋白Cyclin D1、Cyclin E1和波形蛋白Vimentin的表达。11.Western Blot实验结果显示,Forskolin明显抑制了A549细胞的EMT进程,而加入BPO-27后降低了Forskolin的抑制作用。CFTRinh-172促进了A549细胞的EMT进程,而加入Genistein后降低了CFTRinh-172的促进作用。12.Western Blot实验结果显示,CFTR抑制剂CFTRinh-172和BPO-27促进了NF-κB主要家族成员蛋白p65的表达,CFTR激活剂Genistein和Forskolin抑制了p65的表达。结论:本研究发现,CFTR在不同类型肺癌细胞中的表达可能与支气管至肺泡的分级、肺癌细胞的分类、细胞的来源有关。CFTR氯离子通道能够通过调节细胞周期蛋白的表达来影响肺癌细胞的增殖,通过调节EMT进程和NF-κB信号通路的蛋白表达来影响肺癌细胞的迁移。因此,本文对肺癌进展的机制研究具有非常重要的理论意义,能够对特定靶点的肺癌治疗提供理论基础。