研究背景世界范围内,前列腺癌在男性所有恶性肿瘤中发病率位居第二,在美国的发病率已经超过肺癌,成为第一位危害男性健康的肿瘤,在我国其发病率也呈逐年上升的趋势。早期患者可通过根治性手术或者根治性放疗治愈。对于晚期前列腺癌,雄激素剥夺(androgen deprivation therapy,ADT)仍然是主要的治疗方法。虽然初始治疗阶段ADT能有效抑制肿瘤生长,但是在2-3年内超过一半的患者会发展到耐药阶段,也就是我们通常所知的去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC),并且其中位生存期仅为12～18个月。雄激素受体(androgen receptor,AR)信号通路的持续激活仍然是CRPC发生、进展的关键因素。近年来有研究表明,上皮间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)和AR信号通路存在着广泛的串话,在前列腺癌发生以及进展为CRPC的过程中发挥着重要作用。虽然EMT和AR信号通路之间有着密切的联系,但具体到调控机制,不同的研究者得出了不同甚至是矛盾的结论,仍需要进一步的实验加以验证。除AR信号通路外,其它一些信号通路也参与到前列腺癌EMT过程中,包括:RTK、Pten、STAT3、Wnt和Notch-hedgehog等。通过干扰上述信号通路,靶向逆转EMT可能为以后前列腺癌的治疗提供新的思路。成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)及其受体FGFR普遍存在于正常细胞中,共同构成FGF信号通路,在细胞生长、分化、迁移、血管生成以及组织创伤修复中起重要作用。近年研究表明,该通路在前列腺癌的发生、发展中同样发挥重要作用。其作用机制主要是通过激活一系列下游信号通路实现,包括Ras-Raf-Mapk、PI3k-Akt、Stats和PLCγ等。大部分FGFs是通过自分泌或者旁分泌的方式发挥生理作用。FGF19亚科是FGFs家族中特殊的一类,包括FGF19、FGF21、FGF23,它们可通过类似激素的内分泌功能入血从而调节许多生理功能,包括能量和胆汁酸的代谢,糖脂的代谢,以及维持磷、维生素D的动态平衡。有学者先后报道了 FGF19、FGF23能够促进前列腺癌的进展。另有研究提示FGFR1的活化可以导致不可逆的前列腺腺癌和上皮间质转化,促进前列腺癌的进展。尽管大量研究把FGF/FGFR信号通路的激活和肿瘤的进展联系起来,但是在一些特定的条件下,此通路的激活可以表现出抑制肿瘤的作用。此外,一系列的FGFs和FGFRs抑制剂已经应用在了前列腺癌的基础和临床试验中,展现出其广阔的应用前景。FGF/FGFR信号通路的激活需要一个关键分子:βklotho(KLB)。βklotho作为FGF19、FGF21的共受体,可以提高FGF19、FGF21与FGFRs(特别是FGFR1和FGFR4)的亲和性,形成βklotho-FGF19/FGF21-FGFR4复合体,发挥调节血糖、胆汁酸、能量代谢的生理作用。βklotho目前在肿瘤中的研究较少,并且其到底是发挥促癌还是抑癌作用仍存在争议。虽然FGF19/FGFR4信号通路能够促进前列腺癌的进展,但是作为FGF19/FGFR4共受体,βklotho在前列腺癌的表达以及βklotho与前列腺生物学行为的关系还未有报道。二甲双胍是世界范围内治疗2型糖尿病应用最广泛的药物。流行病学研究表明,二甲双胍可以降低多种肿瘤的发病率和疾病进展率。目前已有大量体内、体外研究表明二甲双胍具有广泛的抗肿瘤作用,主要和激活AMPK(AMP-activated protein kinase)通路和增加胰岛素敏感性有关。有研究表明AMPK和AR之间存在负反馈调节,二甲双胍可下调AR表达,抑制前列腺癌的生长。除此之外,二甲双狐在多种肿瘤(包括前列腺癌)的研究中表现出了抗EMT的作用。虽然目前已有大量的二甲双胍抑制肿瘤发生、进展的研究,但是近年的研究热度仍然不减,二甲双胍抗肿瘤的新机制层出不穷。研究表明βKlotho与FGF19-FGFRs形成复合体,具有和二甲双胍类似的降血糖作用,二甲双胍和βKlotho之间是否具有潜在联系,目前还未见报道。第一部分:βKlotho抑制雄激素相关的前列腺癌上皮间质转化目的首先研究雄激素/雄激素受体信号通路与前列腺癌EMT的关系,检测βklotho的表达水平与前列腺癌患者临床参数以及预后的关系,进而在体内、体外实验中探讨βklotho与前列腺癌EMT的关系,从而发现逆转EMT的潜在靶点。方法1.采用Western Blot检测双氢睾酮(dihydrotestosterone,DHT)对于AR阴性细胞系PC3和AR阳性细胞系LNCaP EMT的影响。2.采用Western Blot检测βKlotho在不同前列腺癌细胞系中的表达,免疫组织化学检测βKlotho在前列腺增生和前列腺癌组织中的表达。The Human Protein Altas数据库分析βKlotho在正常前列腺组织和前列腺癌中的表达。3.采用卡方检验检测βKlotho表达水平与前列腺癌患者年龄、肿瘤分期、分级的相关性;通过Kaplan-Meier单因素生存分析法检测肿瘤分期、分级、βKlotho表达水平与生存预后的关系。4.采用CCK-8、克隆形成实验检测βKlotho对于前列腺癌细胞系增殖的影响;采用Transwe丨1、细胞划痕实验检测βKlotho对于细胞迁移、侵袭能力的影响;通过流式细胞仪检测Annexin V-PE/7-AAD染色情况评估细胞的早期凋亡。5.采用Western Blot、细胞免疫荧光法检测过表达和敲减βKlotho对前列腺癌细胞EMT的影响。6.裸鼠成瘤实验检测βKlotho对于前列腺肿瘤生长的影响,免疫组织化学检测βKlotho对于裸鼠前列腺癌EMT的影响。结果1.DHT能够显著下调AR阴性的PC3细胞上皮标记物E-cadherin的表达(p<0.01),上调间质标记物 N-caderin(p<0.05)、vimentin(p<0.05)的表达,上调转录因子slug、snail(P<0.05)的表达。DHT能够激活ERK1/2,MAPK/EPK1/2抑制剂U0126能够反转DHT所致的上述EMT标记物的变化。在AR阳性的LNCaP细胞中,DHT刺激对EMT指标无明显作用。2.βKlotho在PC3、LNCaP、C4-2B三种细胞中均有表达,以LNCaP中的表达量最高,其表达量是PC3的2.24倍(p<0.01),是C4-2B的1.67倍(p<0.01)。30例前列腺增生βKlotho的染色得分:10.15±0.29,30例前列腺癌βKlotho的染色得分:7.47±0.41,两者的差异表达具有统计学意义(p<0.05),高级别(Gleason评分≥7分)患者比低级别(Gleason评分≤6)患者的βKlotho表达量更低。通过对The Human Protein Altas数据库分析,发现前列腺癌中的βKlotho较正常前列腺组织的表达降低,与我们的研究结果一致。3.卡方检验表明βKlotho的低表达与前列腺癌的高分级有关(p<0.05)。βKlotho表达水平与患者的年龄、临床分期无关(p>0.05)。Kaplan-Meier生存分析法,log-rank检验表明βKlotho低表达患者生存率明显低于βKlotho中等表达和高表达患者。肿瘤高分期比低分期预后差,高分级与低分级之间无统计学差异。4.PC3细胞中过表达βKlotho显著降低细胞的增殖能力,增加细胞的早期凋亡,抑制细胞的迁移、侵袭能力。LNCaP细胞中敲减βKlotho能够促进细胞增殖,抑制细胞早期凋亡,促进细胞的迁移与侵袭能力。5.在PC3细胞中过表达βKlotho后能显著上调DHT所诱导的E-cadherin的降低作用(p<0.05),下调 DHT 所诱导的 N-cadherin、vimentin、slug、snail 的升高作用,这种效应在细胞免疫荧光实验中得到证实;LNCaP细胞敲减βKlotho后E-cadherin表达降低,N-cadherin、vimentin的表达升高,这种效应在细胞免疫荧光实验中得到证实。6.裸鼠成瘤4周后,对照组的肿瘤体积为2436±790(mm3),βKlotho过表达组肿瘤体积为1590±504(mm3),差异具有统计学意义(p<0.01)。βKlotho的过表达明显抑制PC3细胞的皮下移植瘤的生长。免疫组织化学表明,βKlotho过表达的裸鼠移植瘤中E-cadherin的表达增高了 2.68倍(p<0.01),N-cadherin的表达降低了 69.7%(p<0.01),snail 的表达降低了 46.1%(p<0.01)。结论1.雄激素对前列腺癌EMT的影响是AR依赖性途径和AR非依赖性途径综合作用的结果。2.前列腺癌细胞系、前列腺癌组织中均存在βKlotho的表达,前列腺癌βKlotho表达较前列腺增生组织降低,βKlotho的低表达与前列腺癌的高分级有关,βKlotho的表达降低是前列腺癌患者生存的不利因素。3.βKlothot通过抑制ERK1/2信号通路抑制雄激素/雄激素受体相关的EMT,在体内、体外实验中发挥抗前列腺癌作用。4.βKlotho作为EMT的抑制因子,可作为晚期前列腺癌治疗的一个新的潜在靶点。第二部分:二甲双胍上调βKlotho抑制前列腺癌上皮间质转化目的首先研究二甲双胍与前列腺癌EMT、与前列腺癌AR信号通路之间的关系。鉴于二甲双胍与βKlotho均有降低血糖的作用,进一步研究两者潜在的关系,并对其机制作初步探究。方法1.采用克隆形成实验、CCK8检测二甲双胍对于PC3、LNCaP细胞增殖的影响。2.采用Western Blot检测二甲双狐对βKlotho,对EMT的影响。3.采用组织块培养方法检测二甲双胍对EMT的影响。4.采用RT-PCR检测二甲双胍对于AR转录活性的影响。5.采用细胞免疫荧光方法检测二甲双胍对于AR细胞分布的影响。6.GEO数据库分析AR蛋白与βKlotho DNA潜在联系。结果1.二甲双胍抑制PC3、LNCaP细胞增殖,具有浓度和时间依赖性。2.在PC3细胞中,二甲双胍能明显激活AMPK信号通路,降低AR的表达,上调E-cadherin的表达,下调N-cadherin的表达,这种效应在组织块培养中得到证实。有趣的是,二甲双胍能够明显上调βKlotho的表达,具有浓度依赖性。在PC3细胞中敲减βKlotho后,二甲双胍所致的E-cadherin的上调,N-cadherin的下调被逆转。3.二甲双胍能够抑制DHT所致的LNCaP细胞AR转录的激活,包括AR以及下游PSA、NKX3.1mRNA水平的降低。并且,二甲双胍能够抑制AR从细胞质到细胞核的转运。4.GEO数据库分析提示AR蛋白与βKlotho DNA在外显子1和外显子2之间存在结合位点,DHT能够促进AR蛋白与βKlotho DNA的结合,而抗雄药物恩杂鲁胺能反转这一现象。结论1.二甲双狐抑制前列腺癌细胞的增殖,上调βKlotho表达,抑制前列腺癌细胞的EMT,这种效应依赖于βKlotho的表达。2.二甲双胍抑制AR信号通路的活性。3.二甲双胍上调βKlotho的可能机制:二甲双胍通过下调AR的表达,抑制AR对于βKlotho启动子区域的抑制作用,刺激βKlotho转录、翻译,上调βKlotho表达。