杧果是著名热带水果,被称为“热带果王”,近年来随着杧果种植产业的持续扩增,使得杧果产区农业经济得到快速发展,同时杧果病虫害的种类随着种植面积的扩大也越来越多。近两年本课题组在广东、四川等杧果产区病虫害普查时发现了一种危害逐渐加重的细菌性病害。杧果的叶片和枝条在染病初期呈现不规则的黑褐色斑圈,中期病斑向四周蔓延,前期出现的症状与细菌性角斑病相似,但后期染病的叶片和枝条干枯坏死,与细菌性角斑病后期出现的病害症状完全不同,固本课题称之为杧果细菌性干枯病。为明确该病原菌的种类,采用稀释涂布分离法,对具有明显症状的杧果病害样品进行稀释分离、纯化,Koch法则检测分离物接种杧果枝叶的致病性,并通过观察分离物的形态学特征、生物学活性测定和分子生物学分析确定其分类学地位。经全基因组测序技术,预测病原菌的致病基因、耐药基因、致病毒力和碳水化合物等相关基因,以期为明确病原菌对寄主产生的致病机理和病害防治途径提供理论依据。主要研究内容如下:1.杧果细菌性干枯病病原菌分离及鉴定以典型的干枯病病样为试验材料,采用稀释涂布法获得NY01菌株。经过刺伤接种将NY01菌株回接到杧果的叶片和枝条上,4天后在杧果的叶片和枝条均呈现典型病斑。NY01菌株在蔗糖蛋白胨培养基上菌体黄色,圆形,表面光滑整齐,菌落边缘随着培养时间的不断延长而逐渐加厚,显微镜下菌体为杆状,革兰氏染色阴性。NY01菌株16SrDNA序列与Sphingomonas sanguinis(登录号KT766073)的同源性达到99.63%。经形态学特征和分子鉴定,将病原菌鉴定为血红鞘氨醇单胞菌(S.sanguinis),该病原菌能够引起杧果细菌性干枯病在国内属首次报道。2.病原菌生物学活性测定NY01菌株生物学活性测定发现,该病菌在NA培养基中生长范围为大于5℃小于45℃间,最适温度为28℃;当pH为>3和<12时NY01菌株均能生长,且最适pH是7.0;盐度为<3.0%时均能生长,最适盐度为0.8%;碳氮源试验显示,该菌不能利用淀粉和亚硝酸钠;葡糖糖发酵试验结果为发酵型;病原菌在有氧或无氧条件下都能利用葡糖糖获得能量;在糖、醇试验中病原菌不能利用甘油作为能量来源。3.NY01菌株的全基因组测序和分析采用第三代单分子实时测序技术对NY01菌株进行全基因组测序,获得一条环状染色体和3个质粒,共4个Scaffold。染色体总长度为3280800 bp,GC含量为67.42%;质粒1长度为275887 bp,GC含量64.56%;质粒2长143601 bp,GC含量64.11%;质粒3长37326 bp,GC含量58.16%。NY01菌株有3593个ORFs,其中染色体3111个、质粒1有296个、质粒2有141个、质粒3有45个,开放阅读框的平均总长度为837462 bp,GC含量为63.31%。通过GO数据库比较,获得55个基因,其中生物学过程有25个、细胞组分19个、分子功能11个。COG数据库比对,将该病原菌分为21类共3334个基因。KEGG数据库比对,菌株注释到1018个基因,其中575个基因参与代谢途径,占KEGG总注释的56%,这些基因代谢途径与基因在细胞中的作用密切相关。通过PHI数据库基因注释,菌株共有279个PHI相关基因,这些基因在病原菌与寄主互作过程中有着不同功能作用,包括细胞壁的合成、运输和代谢、细胞内转运、复制和表达、信号转导和防御等。VFDB注释获得66个致病毒力基因,主要包括鞭毛合成和运动、代谢、胞内运输、转录调节等各种酶类蛋白。经CRDB数据库比对,NY01获得7个耐药基因,其中有1个为抗利福平基因。CAZY数据库注释获得486个碳水化合物相关酶,其中糖苷水解酶家族含量最高,占全部碳水化合物酶的40%,注释的代谢途径丰富完整,基因主要参与碳水化合物、代谢及膜转运等。