论文部分内容阅读
猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是危害全球养猪业的一种重要病原,可引起母猪繁殖障碍和猪呼吸道疾病,并导致感染猪体免疫抑制,造成严重经济损失,但其致病机理尚不十分清楚。CD83作为树突细胞（DCs）的重要表面分子,它不仅仅是DCs成熟的标志,还是DCs发挥其激发免疫应答作用不可或缺的功能性分子。CD83一方面活化DCs,另一方面为初始T细胞和记忆性T细胞提供共刺激信号,但可溶形式CD83分子（sCD83）具有强大的抑制混合淋巴细胞反应（MLR）和DCs介导的同种异体T细胞增殖反应作用。PRRSV与CD83的相互关系及其机制尚无报道。本研究主要内容如下:1.PRRSV诱导树突细胞CD83表达及其关键功能蛋白的探寻本研究采集PRRSV阴性猪外周血液淋巴细胞（PBMC）,采用GM-CSF和IL-4刺激,制备获得单核细胞衍生的树突细胞（MoDCs）,采用PRRSV 3个不同毒力毒株(高致病性毒株BB0907、经典毒株S1及致弱毒株NT0801,分别以不同剂量感染MoDCs,收集细胞和细胞培养液,分别通过流式细胞术检测MoDCs细胞膜CD83（mCD83）表达,夹心ELISA方法检测细胞培养液sCD83表达,qRT-PCR检测MoDCs CD83 mRNA水平,发现3种不同病毒株均可上调mCD83及其mRNA水平,并能够强烈诱导sCD83分泌。采用基因步移试剂盒扩增获得850 bp的CD83启动子基因,克隆至pGL3-Basic质粒,成功建立CD83双荧光报告基因检测系统。将PRRSV BB0907毒株编码蛋白基因克隆至pVAX1,构建成功PRRSV编码蛋白基因真核表达质粒。将不同真核表达质粒与CD83启动子报告基因共转染Marc-145和HEK293细胞,发现PRRSVN、nsp1及nsp10蛋白能够显著上调CD83启动子活性,表明PRRSVN、nsp1及nsp10蛋白在促进MoDCs表达sCD83方面发挥重要作用2.PRRSV N蛋白诱导树突细胞CD83表达及其分子机制本研究利用丙氨酸突变技术,构建PRRSV N蛋白基因的8个连续氨基酸（aa）残基突变体的基因重组质粒,转染Marc-145和HEK293细胞,采用CD83双荧光报告基因检测系统检测,结果显示:N蛋白第43和44aa残基能够上调CD83基因启动子活性。利用PRRSVBB0907毒株感染性cDNA克隆（pBB/wt）,通过融合PCR方法构建上述N蛋白基因突变重组质粒,构建感染性cDNA克隆,拯救获得N蛋白第43和44aa突变重组PRRSV[rK43A和rR44A]及其回复重组病毒[rK43A（R）和rR44A（R）]。该4种重组病毒空斑和生长特性与其野生重组病毒rBB/wt相似,但rK43A与rR44A上调CD83启动子活性明显低于rBB/wt（P<0.001）,rK43A（R）与rR44A（R）上调CD83活性与rBB/wt相似。将4种重组病毒及rBB/wt接种MoDCs后测定CD83表达水平,rK43A和rR44A组中的CD83 mRNA水平,mCD83表达水平及sCD83分泌量都明显低于rBB/wt、rK43A（R）和rR44A（R）组。根据CD83启动子基因序列含有的多个Sp1结合位点及NF-κB结合位点,利用Sp1 siRNA及NF-κB抑制剂研究Sp1及NF-κB在PRRSV N蛋白上调CD83中的作用。CD83双荧光报告基因检测系统检测结果显示,Sp1 siRNA及NF-κB抑制剂均能够阻断PRRSV及N蛋白质粒对CD83启动子的激活,但对rK43A和rR44A重组病毒激活CD83启动子活性无明显差异。rK43A和rR44A重组病毒感染MoDCs诱导的Sp1和NF-κB mRNA水平明显低于rBB/wt。上述结果表明,PRRSV N蛋白N端非共价键区域是PRRSV N蛋白上调CD83的关键区域,PRRSVN蛋白通过Sp1及NF-κB信号通路诱导CD83表达,从而丰富了 PRRSV免疫抑制理论基础。3.PRRSV nsp10蛋白诱导树突细胞CD83表达及其分子机制本研究采用截断体和丙氨酸基因突变技术,构建了 8个连读5aa突变体及多个点突变体重组质粒,与pCD83报告基因共转染Marc-145和HEK293细胞,采用CD83双荧光报告基因检测系统检测,结果显示:nsp10的第192至196aa和214-216aa残基,均能够上调CD83启动子活性。利用PRRSV BB0907毒株感染性cDNA克隆（pBB/wt）,通过PCR方法构建了 nsp10位点基因突变体,拯救获得nsp10蛋白第192-196和214-216aa 突变重组PRRSV[rP192-196A,rG214-216]及其回复病毒[rP192-196A（R）和rG214-216（R）]。Nsp10基因突变重组PRRSV空斑和生长特性与其野生重组病毒rBB/wt相似,但rP192-196A和rG214-216对CD83启动子调节活性明显低于rBB/wt、rP192-196A（R）和rG214-216（R）。将重组病毒接种MoDCs后测定CD83蛋白水平,rP192-196A 和 rG214-216 对 CD83 诱导能力也明显低于 rBB/wt、rP192-196A（R）和rG214-216（R）。此外,Sp1 siRNA及NF-κB抑制剂均能够阻断PRRSV及Nsp10重组质粒对CD83启动子的激活,但对rP192-196A和rG214-216激活CD83启动子活性无明显影响。rP192-196A和rG214-216感染MoDCs诱导的Sp1和NF-κB mRNA水平明显低于rBB/wt组。上述结果表明,PRRSV nsp10的P192-196aa及G214-216aa是PRRSV Nsp10上调CD83的关键区域,PRRSV Nsp10也通过Sp1及NF-κB信号通路诱导CD83表达。4.PRRSV通过sCD83介导抑制MoDCs免疫调节作用本研究利用大肠杆菌表达系统和重组蛋白纯化技术,制备sCD83重组蛋白。将sCD83重组蛋白预处理MoDCs并与PBMC分离的T细胞共培养,结果显示,随着sCD83剂量的增加,T细胞增殖明显减低。采用CD83抗体预先封闭MoDCs后,则其丧失对T细胞增殖的抑制能力。Western blot检测结果显示,sCD83蛋白以剂量依赖的方式抑制LPS刺激的MoDCs中TAP1和ERp57蛋白的表达,表明sCD83能够明显抑制T细胞的增殖,降低MoDCs细胞抗原提呈能力。将PRRSV感染的MoDCs与PBMC中T细胞共培养结果显示,PRRSV感染能够抑制MoDCs促进T细胞增殖,采用CD83抗体封闭MoDCs,PRRSV抑制作用明显降低。同时,PPPSV感染明显抑制MoDCs中TAP1和ERp57蛋白表达。上述结果表明,PRRSV通过诱导sCD83抑制MoDCs抗原提呈及MoDCs介导的T淋巴细胞增殖作用,丰富了 PRRSV免疫抑制机制理论基础。5.PRRSV nsp1通过sCD83介导抑制MoDCs免疫调节作用及其关键氨基酸位点本研究构建了 PRRSV BB0907毒株nsp 1、nsp 1 α及nsp 1 β真核表达质粒,发现仅nsp1α具有上调CD83启动子活性功能。根据nsp1α功能域构建nsp1α截断体,同时利用丙氨酸突变技术构建10个半胱氨酸位点突变的重组质粒,发现nsp1α上调CD83的功能区域位于锌指结构域,nsp1α的C8半胱氨酸对上调CD83也有重要作用。针对锌指结构域,构建12个连续4-6个氨基酸突变的重组质粒及多个点突变重组质粒,发现nsp1α调节CD83的功能位点位于第5aa、6aa、45aa、48aa及61-66aa。因此,构建了 PRRSV BB0907 毒株 nsp1α 第 5-2aa、45a/48a 及 61-6aa 单突变重组病毒[rL5-2A、rG45/G48A、rL61-6A]及双突变体病毒rNsp1α-2m和rNsp1α-3m,随后构建了回复病毒[rL5-2A（R）、rG45/G48A（R）、rL61-6A（R）、rNsp1α-2m（R）和 rNsp1α-3m（R）]。除了 rL5-2A和rNsp1α-3m,其他突变重组病毒空斑和生长特性与其野生重组病毒 rBB/wt 相似,rL5-2A、rG45A/G48A、rL61-6A、rNsp1α-2m 和 rNsp1α-3m 重组PRRSV上调CD83启动子活性明显下降,表明PRRSV nsp1α锌指结构域5-2aa、45a、48a及61-66aa与上调CD83作用密切相关。为了进一步检测nsp1α的免疫抑制效应,将nsp1α突变重组PRRSV感染MoDCs,检测MoDCs抗原提呈相关蛋白TAP1和ERp57表达水平及PRRSV感染MoDCs对T细胞增殖能力,结果显示,与野生重组病毒相比,nsp1α 突变重组病毒 rL5-2A、rG45A/G48A、rL61-6A、rNsp1α-2m 和 rNsp1α-3m感染细胞TAP1和ERp57表达水平明显回升,且T细胞增殖能力也显著回升,表明突变体病的的抑制效应不同程度丧失。上述结果表明,PRRSV nsp1通过sCD83介导抑制MoDCs免疫调节作用,其关键氨基酸位点是第5-6aa、45aa、48aa及61-66aa,从而丰富了 PRRSV nsp1α能够引起机体的免疫抑制的理论基础。