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拟核(Nucleoids)是指原核生物细胞或真核生物线粒体、叶绿体中的DNA-蛋白质复合结构。拟核中的蛋白质除维持拟核的结构稳定性以外,还参与DNA数量的调控、基因表达方式的调控以及细胞或细胞器分裂时DNA的分配等复杂的生命活动。目前,原核生物、酵母线粒体、动物线粒体和植物质体拟核蛋白的研究工作已见报道,但植物线粒体的拟核蛋白却未发现前人的系统阐述。本论文以烟草(Nicotiana tabacum)的培养细胞为实验材料,通过蛋白质组分析的方法揭示线粒体拟核的蛋白质构成。论文的主要结果如下: 1.将继代后生长60个小时的烟草悬浮培养细胞进行酶解和细胞破碎处理后,通过Percoll连续密度梯度离心和蔗糖不连续密度梯度离心相结合的方式获得了纯净的线粒体(MT,MiTochondria)组分。将该组分进行Nonidet P-40裂解和离心,获得了烟草线粒体拟核; 2.获得的烟草线粒体拟核由两部分,即快速沉降组分(RSF,Rapidly SedimentingFractions)和慢速沉降组分(SSF,Slowly Sedimenting Fractions)组成。荧光显微镜、电镜和蛋白免疫杂交的检测结果表明,该两个组分的线粒体拟核均具有较高纯度和良好完整性。同时,PCR检测结果显示这两个组分中均形成了线粒体DNA(mtDNA)的富集(SSF为线粒体组分的8.48倍,RSF为线粒体组分的7.25倍)。由于RSF中的膜含量高于SSF,后续的分析更多地使用SSF: 3.双向电泳结果表明,SSF中可识别的蛋白质染色点与MT相比出现了明显的差异(148/171)。其中,93个蛋白点仅在SSF中出现;19个点在SSF中的浓度比在MT中高两倍以上,而36个点在SSF中的浓度不足在MT中的一半。上述SSF中171个可识别的蛋白质染色点均进行了回收和质谱分析: 4.为了尽量减少分析方法的遗漏,还将双向电泳裂解液和水化液不溶的SSF组分以及SSF全组分分别进行了SDS单向电泳,将泳道中所有的蛋白质进行了分条带或分区回收,并利用LC-Q-TOF MS(Liquid-Chromatography-Quadrupole-Time-Of-Flight MassSpectrometry)与LC-LTQ(Linear-Quadrupole-ion-Trap)MS对这些蛋白质进行了进一步的质谱检测分析: 5.上述质谱检测分析结果经MASCOT检索NCBI(National Center for BiotechnologyInformation)绿色植物库、BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)NCBI拟南芥库及去冗余处理后,最终确定了543个烟草线粒体拟核蛋白质分子。其中GO(GeneOntology)中有注释的蛋白386个,标注未知的蛋白157个; 6.进而利用NCBI CCD(the Concerved Domain Database)、DAVID(the Database forAnnotation,Visualization and Integrated Discovery)和AraNet(Probabilistic Functional GeneNetwork of Arabidopsis thaliana)等数据库对确定的拟核蛋白进行了功能分析。结果表明,上述543个拟核蛋白中,约90％(488/543)参与DNA、RNA和PROTEIN的代谢。其中同时参与三者代谢的蛋白质261个。这一结果充分说明拟核不仅是一个简单的结构单位,更是一个集DNA复制、修复、重组、转录和RNA成熟、翻译以及蛋白加工等生命活动的复杂功能单位; 7.利用DNAbinder(A webserver for predicting DNA-binding proteins)、SUBA(SUB-cellular location database for Arabidopsis proteins)、TargetP(Predict the subcellularlocation of eukaryotic proteins)、Predotar(Prediction of organalle targeting sequences)和SubMito(predict protein SubMitochondria locations)等生物软件的分析结果表明:1)上述543个拟核蛋白的等电点的中位数为8.3(偏碱性),分子量的中位数为45.8kDa(较低),暗示这些蛋白中多数易于与DNA形成结合。蛋白质结构分析的结果也表明约66％(359/543)的分子上存在与DNA有结合潜能的结构域;2)上述拟核蛋白的亚线粒体定位预测结果为69％(375/543)定位于基质、10％(55/543)定位于外膜和21％(113/543)定位于内膜。该结果暗示拟核结构大致可分为两层:中心区蛋白直接与mtDNA结合,外周区则呈现蛋白与蛋白间的互作且与内外膜紧密相连: 8.采用AraNet的分析结果显示:上述543个拟核蛋白中的508个可被预测介入特定的细胞活动通路。其中:1)89％(450/508)参与应激冷、热、氧化胁迫、病毒、双氧水等反应,说明线粒体拟核可能在植物抗逆中发挥重要的作用;2)82％(417/508)参与电子、质子、离子、蛋白、核苷酸等的转运,暗示拟核的能量和物质代谢活跃,可能是线粒体与外界信息互通的中心;3)67％(339/508)参与种子休眠中胚胎发育的停止过程,暗示线粒体拟核蛋白可能影响植物的发育; 9.上面(结果7中)的软件分析结果还显示,本研究确定的拟核蛋白约73％(396/543)预测定位于线粒体,另外约27％(147/543)无预测信息。该结果说明本研究揭示了大量定位和功能未知的线粒体蛋白。这些蛋白的生物学作用值得深入研究; 10.免疫电镜以及普通电镜的观察结果显示线粒体拟核区确实存在转录和翻译结构,即DNA-RNA杂合体及线粒体核糖体,为拟核参加基因转录和蛋白质翻译提供了直接的证据。 综上所述,本研究揭示了烟草线粒体拟核的蛋白质分子组成,继而初步推测了线粒体拟核的基本结构和功能,为深入研究线粒体及线粒体拟核的生物学作用提供了有价值的线索。