目的：通过分子生物学的方法构建抗PD-1scFv-Fc抗体、抗VEGF scFv-Fc抗体以及VEGF-PD-1双特异抗体并表达，并通过蛋白水平和细胞水平的鉴定研究其生物学功能。
　　方法：1.通过酶切连接和同源重组的方法构建抗PD-1scFv-Fc质粒、抗VEGF scFv-Fc质粒。2.293F细胞表达抗体，蛋白A树脂纯化抗体。3.ELISA检测抗PD-1scFv-Fc抗体、抗VEGF scFv-Fc抗体与PD-1抗原、VEGF抗原的亲和力。4.ELISA分别检测PMA和钙离子载体是否能激活Ju rkat细胞；流式细胞术检测刺激后Jurkat细胞PD-1表达以及抗PD-1scFv-Fc抗体与PD-1的结合。5.通过检测IL-2，分析PC3前列腺癌细胞对Jurkat细胞的抑制和抗PD-1scFv-Fc抗体是否能够重新激活被PC3前列腺癌细胞抑制的Jurkat细胞。6.通过CCK-8检测抗VEGF scFv-Fc抗体是否会抑制HUVEC细胞的活力。7.通过Discovery Studio软件分析出亲和力、稳定性均优的双特异抗体序列。8.送于公司合成并通过293F细胞表达抗体。9.对双特异抗体序列进行优化。
　　结果：1.先后通过酶切连接和同源重组的方法构建了抗PD-1scFv-Fc质粒、抗VEGF scFv-Fc质粒。2.利用293F细胞悬浮表达，得到了阳性对照抗PD-1scFv-Fc抗体和阳性对照抗VEGF scFv-Fc抗体表达上清，并通过蛋白A亲和层析成功纯化出阳性对照抗PD-1scFv-Fc抗体和阳性对照抗VEGF scFv-Fc抗体，抗体浓度达到100μg/ml左右。3.ELISA试验发现阳性对照抗PD-1scFv-Fc抗体和阳性对照抗VEGF scFv-Fc抗体能够与PD-1抗原、VEGF抗原结合，并表现出较强的亲和力。4.流式检测发现，PMA和钙离子载体成功激活Jurkat细胞分泌IL-2并表达PD-1。阳性对照抗PD-1scFv-Fc抗体浓度达到10μg/ml时，抗体过量，可与Jurkat细胞膜上PD-1结合。5.PC3细胞的加入抑制了Jurkat细胞的活性，IL-2的浓度显著减少。阳性对照抗PD-1抗体对Jurkat的激活需进一步确认。6.相较于未加入阳性对照抗VEGF scFv-Fc抗体，加入阳性对照抗VEGF scFv-Fc抗体后HUVEC细胞增殖明显减低。7.Discovery Studio软件筛选出亲和力、稳定性均佳的双特异抗体结构。8.成功表达出双特异抗体，但表达量较低。9.优化了双特异抗体的序列。
　　结论：本课题表达的阳性对照抗PD-1scFv-Fc抗体和阳性对照抗VEGF scFv-Fc抗体能够与相应的抗原结合；体外实验显示，阳性对照抗VEGF scFv-Fc抗体能够在细胞水平发挥其抗肿瘤的生物学功能，阳性对照抗PD-1scFv-Fc抗体细胞水平作用正在实验中，有待进一步确定；阳性对照抗PD-1scFv-Fc抗体和阳性对照抗VEGF scFv-Fc抗体蛋白水平和细胞水平的实验为双特异抗体的后续研究奠定了基础。