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猪流感病毒(SIV)是一种正黏病毒科,流感病毒属,有囊膜、分节段的单股负链RNA病毒,是引起流感的主要病原之一。影响流感病毒感染的主要因素包括病毒、宿主和传播途径。越来越多的调查发现,不同地区或者同一地区不同猪场/猪群对同一SIV的易感性和感染程度存在很大差异,使人们认识到外界环境和宿主营养条件对抵抗SIV感染的重要性。黄曲霉毒素B1(AFB1)是目前最常见的一种霉菌毒素,广泛存在于发霉的玉米、小麦和花生等农作物中,具有影响宿主免疫和降低生长性能等作用。所以,在本研究中我们提出AFB1可能促进SIV复制,并深入探讨其作用机理。考虑到猪在SIV传播中的重要地位以及AFB1的广泛暴露,找到一种能够防止猪群免受AFB1暴露和SIV侵害的营养物质变得尤为重要。α-甘露寡糖又称为甘露低聚糖,是从酵母培养细胞壁中提取的一类新型抗原活性物质,可通过物理吸附或直接结合霉菌毒素,消除毒素对机体的有害影响,同时具有增强免疫、促生长及抗病毒等生物学功能。所以,本研究通过体内、体外添加α-MOS来研究其对AFB1促进SIV复制的干预作用及其作用机理。一、AFB1对SIV复制的影响研究本试验中,我们首先检测不同浓度AFB1对猪肺泡巨噬细胞(PAMs)、犬肾细胞(MDCK)和人非小细胞性肺癌肺泡上皮细胞(A549)活性的影响,筛选出对细胞活性无显著影响的AFB1浓度用于后续试验,以排除AFB1诱导的细胞毒性对SIV复制的影响。同时,根据以往文献和国内外关于无毒性AFB1的报道,选择对小鼠相对“安全”的AFB1剂量用于体内试验。接下来,我们以传代PAMs、MDCK和A549以及小鼠为模型,通过体外、体内感染H1N1型SIV,来检测AFB1对SIV复制的影响。细胞试验结果显示:0.01-0.05 μg/ml AFB1能够显著增加H1N1型SIV滴度,增加SIV M mRNA和NP蛋白在PAMs、MDCK和A549上的表达水平。这些结果共同表明低浓度AFB1能够促进H1N1型SIV在体外复制。体内试验结果同样显示:10-40 μg/kg AFB1显著增加H1N1型SIV复制,包括增加病毒M mRNA和NP蛋白在小鼠肺脏的表达水平,同时还能够降低小鼠增重,增加肺指数,加剧肺组织病理损伤。这些结果表明低水平AFBi污染能够促进SIV在小鼠体内感染,并加重病毒感染程度。综上所述,我们的试验结果表明低水平AFB1能够促进H1N1型SIV在体内、体外复制,并加重病毒感染程度。二、AFB1促进SIV复制的TLRs通路研究为了进一步研究AFB1促进SIV复制的机制,我们在体外、体内建立H1N1型SIV感染的传代PAMs和小鼠模型。通过小RNA干扰Toll样受体4(TLR4)、注射TLR4特异性抑制剂(TAK242)和TLR4基因敲除(TLR4 KO)等方法去除TLR4的影响,来比较TLR4干扰/基因缺失前后AFB1促进SIV复制的变化情况。首先,我们使用荧光定量PCR、免疫印迹和免疫组化等技术检测AFB1促进SIV复制过程中,TLR4及其下游因子表达情况。结果显示:野生型小鼠脾脏和PAMs中TLR4表达水平显著增加,TLR4-NFκB通路上调,同时TNF-α表达和血清TNF-α浓度显著增加。体外siTLR4转染试验结果显示:与阴性转染对照相比,TLR4干扰后SIV滴度、病毒M mRNA和NP表达水平显著降低;这说明siTLR4阻碍AFB1对SIV复制的促进作用。此外,在本研究中我们还使用NFκB抑制剂(BAY11-7082)进一步研究AFB1促进SIV复制的机制。结果显示:BAY11-7082显著降低由AFB1促进的病毒滴度的增加,病毒mRNA表达水平的增加以及TNF-α mRNA表达水平的增加,并且与空白对照组无显著差异,表明NFκB的抑制阻碍了 AFB 1促进SIV在PAMs上复制及其所致炎性反应。体内试验结果显示:与注射对照组和野生型小鼠相比,TAK242注射组小鼠和TLR4敲除组小鼠增重和肺指数无显著变化,但是肺脏中病毒M mRNA和NP表达水平以及肺组织损伤显著降低;体内结果进一步说明TLR4抑制/基因缺失阻碍了AFB1对SIV的复制及其所致肺组织损伤的促进作用。综上所述,我们的试验结果表明AFB1可能通过上调TLR4-NFκB从而促进SIV复制及其所致炎症和肺组织损伤,或者至少在TLR4存在的情况下AFB1才会发挥此作用,即TLR4的存在会营造AFB1促进SIV复制及其所致炎症和肺组织损伤的环境。三、AFB1促进SIV复制的巨噬细胞极化机理研究本试验以小鼠和传代PAMs为模型,通过体内、体外感染H1N1型SIV进一步研究是否高浓度、长时间AFB1暴露更为促进SIV复制,并从巨噬细胞极化角度阐明其作用机制。体内试验结果显示:低剂量AFB1显著增加流感病毒M mRNA、NP、M1和M2蛋白在小鼠肺脏表达,同时还能够显著降低小鼠增重,增加肺指数,加剧小鼠肺和脾组织损伤。此外,低剂量AFB1暴露还增加了 SIV感染15天小鼠血清TNF-α含量、脾指数和肺支气管灌洗液中CD206 阳性巨噬细胞数,降低胸腺指数和肺支气管灌洗液中CD80 阳性巨噬细胞数;与此相一致地,在SIV感染18-21天小鼠血清TNF-α含量回到基本水平,随后血清IL-10含量显著升高。细胞试验结果显示:低浓度AFB1同样增加病毒滴度,病毒MmRNA、NP蛋白表达以及NP阳性细胞数;体外流式细胞术和扫描电镜形态学观察结果还显示低浓度AFB1促进SIV感染的PAMs在SIV感染后8 h向促炎性巨噬细胞表型(M1型巨噬细胞)极化,24-48 h向抑炎性巨噬表型(M2型巨噬细胞)极化;最后,通过体外添加脂多糖(LPS)刺激,我们发现LPS能够逆转PAMs向M1型巨噬细胞极化,同时完全抵消由AFB1促进的SIV复制。综上所述,体内、体外试验结果共同表明低水平AFB1可以促进H1N1型SIV在体内、体外复制,同时调节体内和体外肺泡巨噬细胞从M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化,而添加脂多糖逆转M2极化可能有利于消除由AFB1促进的SIV复制。四、甘露寡糖干预AFB1促进SIV复制的作用研究本试验以小鼠和传代PAMs为模型,通过体内、体外感染H1N1型SIV,以及AFB1和α-MOS暴露,来检测α-MOS对AFB1促进的SIV复制的影响。体外试验结果显示:α-MOS阻碍AFB1促进SIV复制,降低SIV滴度、病毒M mRNA和NP表达水平。体内试验结果同样显示:α-MOS显著降低AFB1增加的病毒M mRNA和NP蛋白在小鼠肺脏表达,同时还能够缓解AFB1降低的小鼠增重、增加的肺指数,以及增加的肺和脾组织损伤。综上所述,我们的试验结果表明α-MOS能够阻碍AFB1促进H1N1型SIV复制,同时缓解AFB1暴露加剧的SIV感染程度。五、甘露寡糖干预AFB1促进SIV复制的作用机理研究本试验以小鼠和传代PAMs为模型,通过体内、体外感染H1N1型SIV,以及AFB1和α-MOS暴露,进一步探索α-MOS干预AFB1促进SIV复制及组织损伤的作用机理。体内和体外试验结果共同表明:α-MOS能够从mRNA和蛋白水平降低小鼠的脾脏和肺脏以及PAMs中TLR4、NF-κB和TNF-α的表达。我们通过体外DNA转染进行TLR4过表达,来进一步探讨α-MOS是否是通过抑制TLR4基因表达来削弱AFB1促进的SIV复制及炎性反应。结果显示:在细胞进行TLR4 DNA转染后,α-MOS的保护性作用被显著逆转。因此,我们得出结论,α-MOS可以通过抑制TLR4信号通路来保护PAMs免受AFB1促进的SIV感染及其所致免疫损伤。体外添加TNF-α试验结果表明:增加不同浓度TNF-α后病毒滴度、M mRNA和NP表达水平并没有显著变化。为了进一步证实TLR4在α-MOS削弱AFB1促进SIV感染及其炎性损伤中的作用,本研究使用TLR4KO和野生型(WT)小鼠进行试验。结果显示:与饲喂基础日粮的WT小鼠相比,饲喂500 mg/kg α-MOS的WT小鼠肺脏中SIV M mRNA和NP的表达水平降低;相反,与饲喂基础日粮的TLR4 KO小鼠相比,饲喂500 mg/kg α-MOS的TLR4 KO小鼠肺脏中SIV M mRNA和NP的表达水平无显著差异。这些结果表明,α-MOS以TLR4依赖性方式阻断AFB1促进的SIV感染。与此相似地,α-MOS也以TLR4依赖性方式增加小鼠体重,并降低肺指数。HE染色结果显示:与饲喂基础日粮的WT小鼠相比,饲喂500 mg/kg α-MOS的WT小鼠的肺和脾损伤减轻。相比之下,TLR4 KO废除了α-MOS的保护性作用。总之,我们的数据表明α-MOS以TLR4依赖性方式减轻AFB1促进的SIV感染及其所致组织损伤。综上所述,这些结果共同表明α-MOS能够下调TLR4-NFκB通路,降低TNF-α表达,但是α-MOS可能通过TLR4依赖性而非TNF-α依赖性方式降低TLR4-NFκB通路从而缓解AFB1促进的H1N1型SIV复制及其所致组织损伤。