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近年来,细菌甚至致病菌中存在的抗生素抗性基因(Antibiotic Resistance Genes,ARGs)对人类健康构成了严重威胁。海水养殖环境中普遍能够检测到ARGs,并且海水养殖区沉积物是细菌交换ARGs的“热点”区域。目前大多数研究认为滥用抗生素是导致环境中ARGs出现和富集的主要因素。然而,在没有使用过抗生素或者停止使用抗生素的海水养殖环境中,大量ARGs依然能够长期稳定地存在。因此,研究海水养殖环境中除抗生素以外其他ARGs的影响因素有利于全面了解和控制ARGs的富集和传播。鱼粉是海水养殖饲料的主要成分,被大量释放到养殖水体和沉积物中。目前,关于鱼粉对海水养殖沉积物中ARGs的影响以及削减沉积物中ARGs的方法尚无研究报道。本文通过高通量定量PCR方法和高通量测序技术,分析了代表性鱼粉中ARGs的丰度和多样性;探究了鱼粉对海水养殖沉积物中ARGs的影响和相关机理;考查了养殖水体污染修复技术对应用鱼粉后沉积物中ARGs的削减效果。本文主要研究内容和结果如下:(1)研究了鱼粉本身与ARGs传播相关的风险因子。分析了鱼粉本身抗生素、ARGs、可移动基因单元(Mobile Genetic Elements,MGEs)和潜在致病菌(Human Pathogenic Bacteria,HPB)的水平。结果表明,鱼粉样品中抗生素浓度范围为16.3-54.0 ng/g,其中最主要的类型是磺胺和氟喹诺酮类抗生素。五种鱼粉样本中共检测到对几乎所有抗生素表达抗性的132种ARGs和4种MGEs,ARGs相对丰度的范围是6.9×10-3-4.1×10-1 copies/cell。肉骨粉和鸡肉粉可以作为鱼粉的廉价代替物,但是其中ARGs的α-多样性指数高于鱼粉,并且ARGs的绝对丰度高出鱼粉1-2个数量级。此外,鱼粉中了检出25种不同属的潜在HPB,在总菌群中所占比例为5.0%-25.5%,其中革兰氏阴性菌的数量远远超过革兰氏阳性菌。(2)探究了鱼粉对沉积物中ARGs的影响和相关机理。鱼粉的加入显著地增加了沉积物中ARGs的丰度和多样性,并改变了沉积物中ARGs的结构。鱼粉添加量为0.1%和0.5%的微宇宙沉积物中ARGs的相对丰度逐渐增加,在培养后的第50天丰度最高,分别为2.4×10-2和4.1 ×10-2 copies/cell,高于初始沉积物ARGs相对丰度的3-5倍。MGEs相对丰度的最大值超过了初始沉积物的2倍。相比于没有添加过鱼粉的空白对照组,鱼粉导致了 16个ARGs相对丰度的显著增加(P<0.05),其中氯霉素抗性基因mexF被富集的倍数最大,与初始沉积物相比增加了 105倍。同时,鱼粉中营养物质显著地改变了沉积物微生物群落结构。偏典型关联分析结果表明,沉积物理化性质(总碳、总氮和pH)、MGEs和细菌群落结构共同解释了 ARGs变化的92.4%,细菌群落结构对ARGs总体改变的贡献最大,贡献率为45.0%。基于Bray-Curtis距离矩阵的Mantel检验表明沉积物中ARGs与细菌群落结构之间存在显著相关性(P<0.05)。因此,营养物质诱导的微生物群落结构是沉积物ARGs的主要驱动力。(3)考查了鱼粉-四环素复合污染对海水养殖沉积物中ARGs的影响。与单独添加环境相关浓度四环素的微宇宙实验体系相比,鱼粉-四环素复合添加的沉积物中ARGs丰度更高。沉积物中ARGs和微生物群落结构的主坐标分析均能够表明,沉积物样品根据是否添加鱼粉而聚类,鱼粉是导致组间差异的主要因素。基于Bray-Curtis距离矩阵的Mantel检验表明,沉积物中ARGs和细菌群落结构之间存在显著相关性(P<0.05)。偏最小二乘路径模型表明,环境相关的四环素浓度与MGEs丰度之间没有明显的联系。沉积物理化性质(总碳、总氮和pH)对微生物群落有显著负向直接影响(P<0.05),而对ARGs有显著正向直接影响;微生物群落结构对沉积物中ARGs的正向影响最大;MGEs也是沉积物ARGs变化的重要因素,但影响弱于微生物群落结构。因此,微生物群落结构是沉积物中ARGs的主导因素,同时MGEs也起到了一定的作用。(4)考查了养殖水体污染修复技术对沉积物中ARGs的削减效果。实验结果表明,定期投加H202在实验的前14天有效地降低了沉积物中ARGs的相对丰度,而14天后ARGs的丰度则显著提高。曝气在整个实验过程中,对ARGs没有明显的控制作用。H202处理组、曝气组和鱼粉组ARGs的相对丰度峰值分别为0.045、0.0508和0.0509 copies/16S rRNA gene。H2O2能够降低显著鱼粉添加后MGEs的丰度,并且Pearson’s相关性分析表明ARGs和MGEs之间存在显著相关性(P<0.05),因此,H202可能通过减少水平转移的发生频率进而降低了沉积物中ARGs的相对丰度。由此可见,定期添加H202对于ARGs的去除效果更好,修复时间对去除效果影响很大,修复时间过长则导致ARGs丰度增加。综上所述,本研究发现了鱼粉本身是ARGs的重要储存库,鱼粉的应用显著增加了沉积物中ARGs的丰度和多样性,其中的营养物质是主要驱动因素,而且比环境相关浓度四环素对沉积物中ARG的富集作用更大;并证实了定期添加H202是有效削减沉积物中ARGs的修复工艺。研究结果为海水养殖环境以及其他应用鱼粉环境中ARGs的来源、丰度变化、传播机理及风险管控提供了重要的理论依据。