C2H2类型锌指蛋白Msn2是真菌细胞响应外界逆境胁迫应答的主要转录因子,在真菌细胞的饥饿胁迫、盐胁迫、氧化胁迫、高渗透压胁迫以及低温胁迫等应答调节中起着重要作用。但目前米曲霉中锌指蛋白基因Aomsn2尚无报道。本研究首先对米曲霉Aomsn2基因进行了鉴定,然后通过米曲霉的淀粉酶启动子来构建Aomsn2过表达工程菌株和通过CRISPR技术构建Aomsn2敲除工程菌株。在此基础上通过分析Aomsn2基因对米曲霉的生长及其次级代谢产物曲酸合成的影响,解析Aomsn2基因在米曲霉中调节曲酸代谢的调控机制,进而揭示Aomsn2基因在丝状真菌米曲霉中的功能,以期通过控制调节曲酸基因簇的转录因子来提高曲酸的产量,为开发高产曲酸的工业酿造菌株奠定基础,为利用米曲霉在工业上的应用和曲酸的生产提供理论基础。研究结果有:1.利用已知的Msn2蛋白对米曲霉进行全基因组比对分析发现,在米曲霉基因组中有一个msn2基因,命名为Aomsn2（AO090009000515）。系统发育分析显示Ao Msn2及其同源蛋白被分为2个类群。Ao Msn2属于第一类群,该类群成员都是来自于丝状真菌,而酵母属的成员组成了第二类群,包括酿酒酵母MSN2,表明Ao Msn2与酵母属中的MSN2功能可能存在不同。多序列比对分析发现Ao Msn2锌指蛋白在曲霉属真菌中具有保守性。2.为了探究Aomsn2基因对米曲霉生长的影响,我们构建了两株Aomsn2过表达工程菌和两株敲除菌株。通过对该组工程菌株的表型分析,发现过表达Aomsn2基因会减少菌株的生长直径和生物量,增加孢子数量;而敲除Aomsn2基因会增加菌株的生长直径和生物量,减少孢子数量。说明Aomsn2基因对米曲霉的生长有着重要作用。3.为了探究Aomsn2基因对胁迫下的米曲霉生长的影响,我们分别用刚果红、维生素K3、氯化钠分别对工程菌株进行处理。结果显示,敲除Aomsn2基因降低了米曲霉对外界胁迫环境的敏感性,而过表达Aomsn2基因使米曲霉对于外界胁迫变得更敏感,说明Ao Msn2是米曲霉响应胁迫的重要因子。4.通过探究Aomsn2基因对米曲霉次级代谢产物曲酸的影响,发现敲除Aomsn2基因会抑制米曲霉曲酸合成。5.通过对野生型和Aomsn2敲除菌株的荧光定量PCR分析发现,敲除Aomsn2抑制了曲酸合成相关基因koj A和koj T的表达,但对koj R的表达无影响。6.为了研究Ao Msn2蛋白的转录激活活性,我们将Aomsn2基因连接到BD载体上,然后转化到酵母中,通过分析转化的酵母在筛选培养基上的生长情况,结果表明Ao Msn2蛋白没有转录激活活性。7.利用酵母单杂实验证明了Ao Msn2蛋白能够直接结合在koj T的启动子上,并通过不同长度的koj T启动子结合试验证实了koj T基因ATG上游的496 bp片段为Ao Msn2蛋白结合koj T的关键启动子区域。8.为了进一步探究Aomsn2基因与koj T的关系,我们在koj T过表达菌株中敲除Aomsn2基因,产生了ΔAomsn2-OE-koj T菌株。通过曲酸含量分析表明,过表达koj T能够恢复Aomsn2敲除菌株的曲酸合成量,从遗传上证实了koj T位于Aomsn2下游。也进一步证明了Aomsn2基因是通过调控koj T基因来影响曲酸的合成。