背景及目的:肝脏巨噬细胞包括定居巨噬细胞（KCs细胞）以及从外周血循环募集的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）,在维持肝脏免疫稳态、促进或逆转肝纤维化发展过程中起着重要作用。扶正化瘀方（FZHY）的抗肝纤维化疗效已经在大量的基础和临床实验中得到证实,但FZHY是否可通过调节BMDMs肝内募集以及表型极化从而逆转肝纤维化尚未有研究报导。本研究拟通过临床、动物和细胞实验,探讨FZHY通过调控BMDMs向肝内募集及表型极化逆转肝纤维化的免疫调节机制方法:1.临床实验:（1）收集临床肝穿刺组织样本,通过HE及天狼猩红病理染色观察肝组织炎症及纤维化程度;通过免疫组化染色观察肝硬化组织肝内巨噬细胞相关表型相关分子变化特点。（2）基于“十二五”国家重大专项临床肝穿刺样本,HE及天狼猩红病理染色观察肝组织炎症及纤维化程度;免疫组化检测其肝内单核衍生巨噬细胞及恢复性巨噬细胞变化特点,探讨FZHY对人肝脏巨噬细胞表型的调控作用。2.动物实验:（1）采用0.5%DMN腹腔注射,分别设1、2、3、4周四个时间点动态观察观察肝组织炎症及纤维化病理学变化;通过流式细胞术检测肝内募集BMDMs数量、肝内促炎性巨噬细胞亚群动态变化、募集促炎性巨噬细胞及恢复性巨噬细胞变化和树突状细胞亚群变化。（2）制备DMN诱导肝纤维化小鼠模型,设正常组、正常+FZHY组、DMN模型组、DMN+FZHY组。DMN造模4周后再灌胃给药治疗2周,记录小鼠体重及一般情况,检测小鼠血清ALT、AST生化指标,HE和天狼猩红病理染色评价肝组织炎症及纤维化程度,免疫组化检测恢复性巨噬细胞CD206、ARG-1及促炎性巨噬细胞CCL2、i NOS表达;流式细胞术检测肝内募集单核衍生巨噬细胞数量、肝内促炎性巨噬细胞亚群动态变化、募集促炎性巨噬细胞及恢复性巨噬细胞变化和树突状细胞亚群变化。RT-PCR检测巨噬细胞TNF-α、TGF-β1、MMP9/12 m RNA表达变化。3.细胞实验:体外分离小鼠原代肝星状细胞（HSC）和骨髓来源单核衍生巨噬细胞（BMDM）,首先采用CCK-8法测定FZHY对BMDM最大无毒浓度;采用脂多糖（LPS）诱导M1型BMDM,通过RT-PCR检测TNF-α和i NOS基因表达;通过流式细胞术检测BMDM促炎性细胞表面抗原分子CD86、Ly6C和CCR2以及恢复性细胞表面抗原分子CX3CR1的表达变化;最后,将FZHY+LPS预孵育培养BMDM细胞所获得的细胞上清与HSC共培养,通过免疫荧光法检测HSC中α-SMA的表达变化。结果:1.临床实验:（1）肝脏巨噬细胞在不同程度肝硬化患者及FZHY治疗乙肝肝硬化组织中表型变化特点研究发现:通过HE及天狼猩红观察正常供肝、F1-F6乙肝患者肝组织病理变化,与正常供肝组相比,随着肝纤维化程度增加,乙肝患者肝组织汇管区浸润炎性细胞增加,汇管区周围胶原沉积增加。免疫组化检测巨噬细胞表型相关分子,与正常供肝组相比,随着肝纤维化程度增加,乙肝患者肝组织汇管区炎性细胞浸润区域CCR2表达明显增加;随着肝纤维化程度增加,乙肝患者肝组织汇管区周围CD163表达明显减少。（2）基于国家“十二五”重大专项临床样本,观察FZHY联合ETV治疗乙肝肝硬化肝内恢复性巨噬细胞变化特点,研究证实肝硬化患者在没服用ETV（ETV+Placebo-0W组）或ETV+FZHY（ETV+FZHY-0W组）,肝内炎细胞浸润区CCR2表达明显增多;经过48W药物治疗后ETV+Placebo或ETV+FZHY组肝内CCR2表达明显减少,两组无明显差异。肝硬化患者在没服用ETV（ETV+Placebo-0W组）或ETV+FZHY（ETV+FZHY-0W组）,肝内CD163表达明显下降;经过48W药物治疗后ETV+FZHY组肝内CD163表达明显增多,ETV+lacebo组肝内CD163表达无明显差异;与ETV+Placebo治疗组比较,ETV+FZHY治疗组肝内CD163表达明显。2.动物实验:（1）动态观察DMN肝纤维化模型小鼠肝内单核衍生巨噬细胞变化特点发现:随着DMN造模时间延长肝内单核细胞衍生的巨噬细胞逐渐增多,第1周DMN造模第1周小鼠肝内单核细胞衍生的巨噬细胞比例为2.15±0.10%,DMN造模4周后比例为9.42±0.20%;DMN造模第1周,小鼠肝内CD11b+Ly6Chigh促炎性巨噬细胞比例为3.88±0.04%、DMN造模第4周后比例为17.63±0.15%;DMN造模第1周后,小鼠肝内Ly6ChighCCR2+促炎性巨噬细胞比例为13.70±0.80%,DMN造模第4周后比例为27.70±0.53%;DMN造模第1周后,小鼠肝内Ly6ClowCX3CR1+恢复性巨噬细胞比例为0.79±0.20%,DMN造模第4周后比例为1.91±0.46%;DMN造模第1周后,小鼠肝内CD11b+CD11c+髓样树突状细胞比例为38.57±1.00%,DMN造模第4周后比例为34.37±1.60%。（2）FZHY对DMN肝纤维化小鼠肝内单核衍生巨噬细胞募集及调控作用研究发现:与正常组相比,DMN模型组血清ALT、AST水平明显升高,肝组织大量炎性细胞浸润及胶原沉积,肝内KCs占比明显降低、单核衍生巨噬细胞占比明显升高,促炎性巨噬细胞占比明显升高、恢复性巨噬细胞占比明显降低,髓样树突状细胞比例明显升高;肝内巨噬细胞TNF-α、TGF-β1 m RNA表达明显升高,MMP9/12m RNA表达明显降低;与DMN模型组相比,FZHY组肝功能生化指标均显著降低,肝组织炎症及胶原沉积明显减轻;肝内KCs占比无明显变化、单核衍生巨噬细胞占比明显降低,促炎性巨噬细胞占比明显降低、恢复性巨噬细胞占比明显升高,树突状细胞比例明显升高;肝内巨噬细胞TNF-α、TGF-β1 m RNA表达明显降低,MMP9/12 m RNA表达明显升高;3.细胞实验:FZHY体外调节巨噬细胞极化发挥抗肝纤维化的作用机制研究发现:FZHY在800μg/ml对BMDM细胞无明显毒性;LPS诱导的促炎性BMDM细胞TNF-α、TGF-βm RNA表达量明显升高。LPS诱导的促炎性BMDM细胞表面分子CD86、Ly6C及CCR2表达明显增加,CX3CR1表达减少;与LPS模型组相比,FZHY组BMDM细胞TNF-α、TGF-βm RNA表达量明显减少;BMDM细胞表面分子CD86、Ly6C及CCR2表达明显减少,CX3CR1表达增加;FZHY药物在400μg/ml时可以抑制HSC活化及α-SMA;LPS刺激BMDM细胞所得上清与早期活化的HSC共培养后,HSC细胞中α-SMA表达明显增加、BMDM分泌TNF-α、TGF-β量明显增加,而100μg/ml FZHY预孵育LPS刺激BMDM细胞后所得上清与早期活化的HSC共培养后,HSC细胞中α-SMA表达明显减少。结论:1、随着乙肝患者肝硬化程度加剧,肝内募集促炎性巨噬细胞的趋化因子表达逐渐增多,恢复性巨噬细胞数量逐渐减少;FZHY联合恩替卡韦（ETV）治疗的乙肝肝硬化患者肝内募集单核衍生巨噬细胞数量明显减少、恢复性巨噬细胞数量明显增多;与ETV+Placebo治疗组比较,ETV+FZHY治疗组肝内恢复性巨噬细胞数量更多。结果表明,肝内恢复性巨噬细胞数量与肝硬化程度成负相关,FZHY可能通过增加肝内恢复性巨噬细胞数量起到逆转肝硬化的作用。2、随着DMN造模时间的增加,肝内BMDMs数量明显增多,促炎性巨噬细胞比例明显升高、恢复性巨噬细胞比例明显降低,髓样树突状细胞占比明显升高。结果表明,降低恢复性巨噬细胞比例、增加促炎性巨噬细胞比例促进DMN诱导的肝纤维化进展。3、FZHY通过减少BMDMs向肝内募集,同时降低肝内促炎性单核巨噬细比例、增加恢复性巨噬细胞比例,增加树突状细胞比例,;减少促炎性巨噬细胞TNF-α、TGF-β表达,增加恢复性巨噬细胞MMP9、MMP12表达起到治疗DMN小鼠肝纤维化的药理效应。4、FZHY能够抑制LPS诱导BMDM的促炎性极化,促进BMDM向恢复性极化;FZHY通过减少促炎性BMDM细胞中TGF-β及TNF-α分泌,抑制HSC细胞活化,从而发挥抗肝纤维化的作用。