论文部分内容阅读
过敏性疾病影响着全世界近1/4的人口,其中3%-5%为食物过敏,被世界卫生组织列为21世纪重点防治的三大疾病之一。2005年7月19日,美国国会通过一项“食品过敏源标签和消费者保护法(FALCPA)”法案,要求食品生产商清楚地标明该食品是否含有8种最常见的食品过敏原。而在检验检疫系统对进出口的食品进行常见的8大类过敏原(蛋、奶、大豆、花生、小麦、树果、鱼和贝类)检测,缺乏相应的标准和方法。本文致力于研究鸡蛋和小麦过敏原的检测方法,并为制定相应的标准提供理论依据。卵清蛋白是鸡蛋的主要蛋白质,也是鸡蛋的主要过敏原之一。本文制备了抗卵清蛋白单克隆抗体,建立了常见过敏原鸡蛋卵清蛋白的ELISA检测方法。以PBS溶解高纯度卵清蛋白,免疫8周龄的BALB/c小鼠3次,直至效价达到10-5之后,再加强免疫1次,三天后取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞经PEG融合,经间接ELISA和有限稀释法筛选,获得了6株分泌抗卵清蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别是OVA-1C6、OVA-2F9、OVA-2D8、OVA-2D2、OVA-3H6、OVA-3G9,培养上清效价分别为1:30000、1:30000、1:10000、1:10000、1:5000、1:50000,细胞冻存复苏后效价不变；OVA-1C6的亚型是IgG2b,OVA-2D8和OVA-2D2是IgG2a,OVA-2F9、OVA-3H6和OVA-3G9的亚型是IgG1；与BSA、猪血清、兔血清均没有交叉反应。选取其中抗体效价最高的两株杂交瘤细胞OVA-2F9和OVA-3G9,制备腹水以及纯化,纯化后的抗体分别与HRP偶联。将偶联成功的HRP-2F9抗体作为酶标抗体,OVA-3G9作为包被抗体,经方阵滴定法确定最适的包被抗体浓度是1：200和酶标抗体工作浓度是1:1000,在最适浓度下优化双抗体夹心ELISA测卵清蛋白的条件。利用优化后的试验条件进行ELISA双抗体夹心法检测,建立卵清蛋白的标准曲线。检测的最佳线性范围是97.66ng/ml-6250ng/ml,r≥0.995,最低检测限度为97.66ng/ml,大约0.1ppm。在同一次实验内,样品的回收率在91.92%-100.34%之间,精密度CV为1.22%-5.14%,3次试验间精密度CV为3.17%-6.83%。可在4℃放置一个月。与鸡肉、猪肉、牛肉无交叉反应,对鸡蛋、鸭蛋、鹌鹑蛋中的卵清蛋白具有特异性。自制的ELISA试剂盒与RIDASCREEN成品试剂盒检测实际样品进行比较结果基本相符,并且检出灵敏度为成品试剂盒(1ppm)的10倍。醇溶蛋白是小麦等谷物类的主要过敏原,约占小麦种子贮藏蛋白总量的40%,因此可以作为小麦的检测指标,本文建立常见过敏原小麦醇溶蛋白的ELISA检测方法。以65%乙醇溶解sigma公司的小麦醇溶蛋白免疫BALB/c小鼠,免疫血清作为阳性对照。以鼠抗醇溶蛋白单抗为包被抗体,HRP标记兔抗醇溶蛋白多抗为酶标抗体,以方阵滴定法确定包被抗体的包被浓度是2μg/ml和酶标抗体的最适工作浓度是1:8000,在最适浓度下选择合适的封闭液,即含10%胎牛血清的PBST,建立双抗体夹心ELISA法检测醇溶蛋白,拟合标准曲线并制备醇溶蛋白试剂盒。检测的最佳线性范围是19.53-5000ng/ml, R2>0.99,最低检测限为19.53ng/ml,对应的食品样品检测限为7.81ppm。样品的回收率在93.57%～105.72%之间,试验内CV为3.07%-5.91%,试验间CV为0.26%-5.24%,对大麦有一定的交叉反应性,可在4℃放置两周,稳定性较好。本文分别建立了卵清蛋白定量和醇溶蛋白ELISA定量检测方法。准确度、精密度和稳定性均较高。其中卵清蛋白ELISA检测试剂盒定量检出灵敏度是进口产品的10倍,检测费用大约只有进口产品的一半,试剂盒的技术参数优于或达到国外同类产品的水平,能满足日常进出口检测的要求,并为国内制定相应的方法和标准奠定了理论基础。