论文部分内容阅读
目 的 研究逆转录病毒介导诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)基因转染对体外培养的大鼠主动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)增殖的影响,探讨iNOS转基因治疗血管移植术后再狭窄的可行性。 方 法 用脂质体(lipofectamine)介导重组逆转录病毒质粒PLXSN-iNOS、PLXSN导入包装细胞PA317,经G418筛选出抗性克隆;用NIH3T3细胞测定病毒上清滴度;将不同滴度的病毒上清转染体外培养的VSMC;采用RT-PCR、Western-blot检测VSMC内iNOS mRNA和蛋白的表达;用Griess法检测iNOS转基因细胞的培养液中一氧化氮(nitric oxide, NO)的含量;用改良MTT法检测iNOS转基因对VSMC增殖的抑制作用。结 果 1. 本研究获得PLXSN-iNOS、PLXSN转染的PA317细胞抗性克隆制备的逆转录病毒上清病毒滴度分别为8.7×105CFU/ml 、8.1×105CFU/ml。2. 采用不同滴度的PLXSN-iNOS转染体外培养的VSMC 48h后,在VSMC内可检测到外源性iNOS mRNA和蛋白,表达水平随病毒滴度的增加而增强,呈现剂量依赖性;而用最高滴度的PLXSN转染体外培养的VSMC 48h后,在VSMC内未能检测到外源性iNOS mRNA和蛋白表达。3. iNOS转基因细胞的培养液中NO含量显著增高,同时VSMC增殖受到<WP=4>明显抑制,均呈现剂量依赖性。结 论 逆转录病毒介导iNOS基因可高效转染体外培养的VSMC,并在细胞内表达活性的iNOS蛋白,而且产生大量的NO,明显抑制VSMC增殖。为iNOS转基因治疗血管移植术后再狭窄的临床应用提供有力的实验依据。