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缺血性脑卒中(cerebral ischemic stroke)是由于脑部血液循环障碍而引起的脑组织损伤疾病。缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury)是卒中治疗过程中存在的主要损伤形式,危害极大且预后不良。目前尚无疗效好,安全性高的药物。炎症反应伴随缺血性脑损伤的发生和发展过程,IL-1是其中的一种重要炎症因子,其在缺血再灌注后的继发性炎症反应中也发挥着至关重要的作用。IL-1RA是天然抗炎因子,能拮抗IL-1信号传递,阻断其下游炎症介质的合成和发挥作用。研究表明,IL-1RA对于脑缺血性损伤,创伤性脑损伤和蛛网膜出血等脑血管疾病,均具有一定的治疗作用,但疗效不显著,其主要原因是血脑屏障(BBB)限制了IL-1RA有效地进入到脑组织炎症损伤部位。近年来,基于细胞渗透肽(CPPs)技术发展了一种非入侵输送大分子穿透细胞膜的方法,它可以携带大分子渗透一些生物膜结构,包括皮肤和血脑屏障等,发挥其生物学效应。PEP-1,两性多肽,是细胞渗透肽的一种,目前已被广泛应用与输送大分子到不同的组织器官。因此PEP-1的应用可能为IL-1RA提供了一种新的临床机遇,特别是为其更有效地拮抗脑缺血再灌注损伤中的炎症反应提供了可能性。本研究将IL-1RA和PEP-1的功能进行了融合,首次构建了IL-1RA-PEP融合基因,在原核表达系统中实现了高效表达,表达IL-1RA-PEP融合蛋白占全菌总蛋白的30%以上。采用阴、阳离子交换层析和分子筛层析对融合蛋白进行了纯化,获得了纯度为95%的IL-1RA-PEP融合蛋白。EL4细胞学活性研究表明IL-1RA-PEP具有拮抗IL-1α的生物学活性,且其拮抗能力要优于IL-1RA;同时,荧光定位显示IL-1RA-PEP具有穿透上皮细胞Ha Ca T细胞膜的能力,且主要聚集在细胞质和细胞核内。应用线栓法大鼠大脑中动脉阻断模型(MCAo),静脉注射IL-1RA-PEP融合蛋白,24小时后分析其渗透大鼠脑组织的效率,以及其抑制脑组织炎症反应的能力。结果显示,IL-1RA-PEP有效地渗透了缺血再灌注后大鼠脑组织,降低了大鼠脑组织梗死体积,减轻了脑水肿,改善了大鼠神经缺陷评分,大鼠血清和脑组织中炎症性因子含量下降,脑组织中巨噬细胞侵润减轻,中性粒细胞活化的数量减少。初步分析IL-1RA-PEP融合蛋白对脑缺血再灌注损伤的治疗机制。研究发现,IL-1RA-PEP能够显著调节NF-ΚB信号通路,通过下调NF-ΚB通路,抑制了炎症性因子的表达,及炎性细胞的侵润和活化,对缺血再灌注继发性炎症反应具有显著的抑制作用。综上所述,1)构建了IL-1RA-PEP融合基因,经过诱导表达,纯化制备了IL-1RA-PEP融合蛋白,且其具有拮抗IL-1的生物学活性和渗透上皮细胞膜的能力;2)证明了IL-1RA-PEP对脑缺血再灌注具有较好的保护性作用,其能有效的减少脑梗死,减轻脑水肿,降低神经缺陷,抑制脑组织继发性炎症反应;3)探究了IL-1RA-PEP主要是通过调控NF-ΚB信号通路,从而对脑缺血再灌注损伤起到一定的治疗作用。总之,本研究构建具有透膜和抗炎双功能的融合分子IL-1RA-PEP,为研发新型治疗缺血再灌注脑损伤的药物奠定基础。