鸡大肠杆菌病(Chicken colibacillosis)是由某些血清型致病性大肠埃希氏菌(Escherichiacoli,简称大肠杆菌E. coli)引起的各种传染性疾病的总称,临床表现呈多种症型,较为常见的包括急性败血症、气囊炎、肝周炎、心包炎、卵黄炎性腹膜炎、肠炎、脐炎及肿头综合征等。该病发病率和死亡率均很高,是严重危害养殖业发展的主要细菌疾病,常给养鸡业带来巨大的经济损失。临床常用抗生素、化学抗菌药或疫苗进行治疗,但药物残留严重,耐药性及多种致病性大肠杆菌血清型限制疫苗普遍应用等问题不断凸显。为开发低成本、疗效好、低残留的新型抗鸡大肠杆菌病药物,本研究选择经典方剂“白头翁散”并在中医基础理论的指导下对其进行合理的调整与加味,组方形成“加味白头翁散”,并利用现代提取方法,对处方中的有效成分进行了提取。考察指标为中药复方提取物的得率、对临床分离鸡大肠杆菌的体外最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)、最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration, MBC)及提取物中的主要成份秦皮乙素(aesculrtin)和盐酸小檗碱(berberine hydrochloride)的含量,最终筛选得到“加味白头翁散”有效成分的最佳提取工艺,并将提取得到的中药复方有效成分制备成颗粒制剂,建立该颗粒制剂的质量标准,最后观察该颗粒剂对鸡大肠杆菌病的临床疗效。主要研究结果如下：1采用单因素试验,以提取溶媒为单因素考察对象,以提取物有效部位提取率、对鸡大肠杆菌临床菌株的MIC值和MBC值、有效部位中秦皮乙素及盐酸小檗碱含量为考察指标,采用冷凝回流提取法、体外平皿稀释法及反向高效液相色谱法初筛适宜的溶媒。结果显示,溶媒乙醇浓度在30%、50%、60%、70%和95%时,有效部位提取率分别为20.93%、23.02%、22.08%、22.44%和18.34%;对大肠杆菌MIC值分别为3.270mg·mL-1、3.597mg·mL-1、3.450mg·mL-1、3.506mg·mL1-和5.731mg·mL-1; MBC值分别为13.080mg·mL-1、7.194mg·mL-1、6.900mg·mL-1、7.012mg·mL-1和5.731mg·mL-1;秦皮乙素含量分别为0.04%、0.08%、0.10%、0.11%和0.07%；盐酸小檗碱含量分别为0.19%、0.45%、0.37%、0.55%和0.38%。结果表明,以浓度为50%、60%、70%的乙醇为提取溶媒时各对应考察指标值均明显优于以浓度为30%和95%乙醇为提取溶媒的试验组,因此初选浓度50%、60%、70%的乙醇用于下一步正交试验筛选最佳提取工艺。2采用L9(34)正交试验,以料液比(A)、提取次数(B)、提取时间／次(C)及乙醇浓度(D)为考察因素,以提取物有效部位浸膏得率、对鸡大肠杆菌临床菌株的MIC和MBC、浸膏中秦皮乙素含量及盐酸小檗碱含量为考察指标,采用冷凝回流提取法、体外平皿稀释法及高效液相色谱法筛选最佳提取工艺。经过正交试验分析及方差分析最终确定最佳提取工艺组合为A3B3C1D2即料液比为1:10,提取次数为3次,0.5小时／次,60%乙醇浓度。在该工艺条件下,复方有效部位浸膏得率为24%；对临床分离鸡大肠杆菌的MIC和MBC值均为3.750mg·ml-1;秦皮乙素及盐酸小檗碱的含量分别为0.13%和0.57%。3优选“加味白头翁”颗粒剂的辅料组成,考察其各方面性质。首先按照实验室颗粒剂制剂方法,筛选适宜的药液(提取后溶液浓缩到2g生药·mL-1浓度)与辅料总量比例,主要以软材品质和颗粒外观作为指标。结果表明,当药液与辅料比例为1:5时,软材品质及颗粒外观均合符标准。正交试验优选辅料组份,选择常用的可溶性淀粉、α-乳糖及糊精用量及作为黏合剂的羧甲基纤维素钠(HPMC)溶液的不同浓度为因素,以外观、澄明度、含水量为考察指标,确定各辅料的最佳组合。结果表明,“加味白头翁”颗粒剂的最佳处方为,可溶性淀粉：a-乳糖：糊精为3:1:1,且以0.3%HPMC为黏合剂。在该工艺下制备的颗粒剂外观色泽均匀,少碎末；澄明度良好,微有浑浊；含水量约为2.90%。以上各指标符合中药颗粒剂的质量要求。4采用岛津SH MADZU LC-2010C HT (CLASS-VP6.13multi)高效液相色谱系统,建立“加味白头翁”颗粒中秦皮乙素及盐酸小檗碱的含量测定方法。将颗粒剂用甲醇溶解,以色谱条件为色谱柱为Krom asil C18柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相为乙腈—0.1%磷酸(12:88,v/v)；柱温为25℃；流速为1.1mL·min-1;检测波长为334nm；进样量为10μL。理论塔板数按秦皮乙素峰计算应不低于5000块·m-1测定秦皮乙素含量。结果显示：在21.60μg·mL-1～129.60μg·mL-1范围内呈良好的线性关系(r=0.9997,n=6),加样回收率为98.27%,RSD=1.16%(n=6)。以色谱条件为Krom asil C18柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相为乙腈与0.03mol·L-1磷酸二氢钾溶液体积比30:70的混合溶液,流速1mL·min-1紫外检测波长：265nm,柱温：30℃,进样量为10μL,测定颗粒中盐酸小檗碱含量。结果显示：在93.00μg·mL-1～186.0μg·mL-1范围内呈良好的线性关系(r=0.9997,n=6),平均回收率为99.49%。RSD=0.76%。“加味白头翁”颗粒剂中秦皮乙素及盐酸小檗碱的平均含量分别为0.36mg·g-1和2.90mg·g-1。结果表明,该方法简单、灵敏、准确可靠。5观察“加味白头翁”颗粒剂对自然感染致病性大肠杆菌鸡的疗效。挑选若干只患病症状基本相同的病鸡,进行临床及实验室病症确诊,确诊后,随机挑选150只病鸡平均分为5组,I组为复方颗粒低剂量组(2%,颗粒质量:饲料质量)；Ⅱ组为复方颗粒中剂量组(4%,颗粒质量：饲料质量)；Ⅲ组为复方颗粒高剂量组(8%,颗粒质量：饲料质量);Ⅳ组为1%磺胺间甲氧嘧啶西药标准用量对照组；V组为空白组(不投药),每组30只,并进行对应饲喂治疗。投药期7天后,对“加味白头翁”颗粒剂的疗效进行初步的评估。结果显示,空白组无疗效率为76.7%,磺胺组无疗效率43.3%,中药低剂量组无疗效率为56.7%,中药中剂量组无疗效率为40%,中药高剂量组无疗效率为36.7%。空白组死亡鸡与未死亡鸡经临床病征判断、实验室病原菌分离和病理切片表明该组病鸡呈现典型的和严重的大肠杆菌疾病特征；磺胺组和中药组死亡鸡与未死亡鸡经临床病征判断、实验室病原菌分离和病理切片表明患病鸡只经磺胺药物和“加味白头翁”颗粒剂治疗后,疾病得到有效控制。以上结果说明“加味白头翁”颗粒具有效治疗鸡大肠杆菌病的功效,且以4%的添加量最佳。