青蒿素(artemisinin)是从一年生草本植物黄花蒿(Artemisia annua L.)中分离提取的一种含有过氧桥基团结构的新型倍半萜内酯,它是治疗脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾的特效药物。青蒿素联合疗法(Artemisinin Combination Therapies, ACTs),已成为世界卫生组织(World Health Organization, WHO)推荐的治疗疟疾的首选方法。青蒿素除具有抗疟作用外,还具有抗孕、抗纤维化、抗血吸虫、抗弓形虫、抗心律失常和肿瘤细胞毒性等作用。青蒿素及其衍生物作为新型抗疟药,具有高效、快速、低毒、安全等特点。但是青蒿素在野生黄花蒿中含量极低,远不能满足市场的需求。化学合成青蒿素,产率低、成本高、毒性大也不适用于生产。近年来,随着青蒿素生物合成途径分子生物学研究的深入,为利用遗传工程技术提高黄花蒿中青蒿素及其他倍半萜的含量奠定了基础。羟甲基丁烯基-4-磷酸还原酶是位于质体中2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸途径(或非甲羟戊酸途径)(2-C-Methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway(or non-mevalonate pathway), MEP)上最后一个关键酶,催化羟甲基丁烯基-4-磷酸(hydroxymethylbutenyl-4-diphosphate, HMBPP)转化为异戊烯基焦磷酸(isopentenyl diphosphate, IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate, DMAPP)(5:1)的混合物。羟甲基丁烯基-4-磷酸还原酶基因(hdr)的表达情况与植物次生代谢产物的合成有着重要的联系。紫穗槐二烯合成酶催化法呢基焦磷酸(farnesyl diphosphate, FPP)环化为紫穗槐二烯,是青蒿素生物合成下游途径的第一个限速步骤。过表达紫穗槐二烯合成酶基因(ads)能够充分利用青蒿素生物合成上游途径的底物,使更多的中间代谢物质转化为目的终产物青蒿素。本研究以黄花蒿为材料,以羟甲基丁烯基-4-磷酸还原酶(hydroxymethylbutenyl4-diphosphate reductase, HDR)基因和紫穗槐二烯合成酶(amorpha-4,11-diene synthase, ADS)基因为研究靶点,克隆黄花蒿hdr和ads基因的编码区,构建高效植物表达载体pCAMBIA1304+-ads-hdr,并将该载体导入根癌农杆菌LBA4404,获得工程菌LBA4404-pCAMBIA1304+-ads-hdr。农杆菌介导遗传转化,采用叶盘法将hdr和ads基因导入黄花蒿,潮霉素筛选获得黄花蒿抗性芽,30d左右待抗性芽长至2-3cm将其转至MS+0.05mg·L-1NAA+Cab250mg·L-1培养基上进行生根培养。经多次继代后对抗性植株进行基因组PCR检测。同时检测vir基因片段、hygr抗性基因片段、目的基因ads和hdr片段(携带有部分CaMV35S启动子序列)并与阳性对照和阴性对照进行对比。最终从72株具有潮霉素抗性的黄花蒿植株中筛选出6个双基因共转化黄花蒿植株克隆系,其编号依次为ah3、ah11、ah20、 ah27、ah28、ah70。对检测为阳性的植株在MS+1.00mg·L-16-BA+0.05mg·L-1NAA诱导培养基上进行快繁,再诱导生根,随后进行炼苗移栽。8月中下旬对种植的转基因黄花蒿进行取样,并以同期种植的非转基因野生型黄花蒿为对照,采用石油醚和甲醇等有机溶剂超声辅助提取青蒿素,用HPLC-ELSD法进行青蒿素含量测定。结果显示,不同转基因黄花蒿株系中青蒿素含量差异较大,ah70、ahll、ah3、ah20、ah27、ah28株系青蒿素含量分别为0.53mg·g-1DW、0.51mg·g-1DW、0.27mg·g-1DW、0.46mgg-1DW、0.39mg·g-1DW、0.47mg·g-1DW,与非转基因株系青蒿素含量0.15mg·g-1DW相比都有不同程度的提高。青蒿素含量最高的ah70株系为非转基因对照的3.48倍。同时田间试验发现,ah3、ah20和ah70这3个转基因株系的长势异于野生型对照和其他转基因株系,其表现为植株矮小,易伏倒,较早的表现出衰老迹象。对收集的转基因和野生型材料进行hdr和ads基因的表达量分析,其结果与青蒿素含量基本一致,其表达量都相对于野生型有不同程度的提高。由于转基因插入位点,拷贝数不同等原因,使得hdr和ads基因表达量与青蒿素含量之间并没有呈现绝对的对应关系。hdr和ads基因表达量都相对较高的ah27株系其青蒿素含量并不是最高的,反而是ah70株系的青蒿素含量最高,这也可能与ah70株系本身异于野生型植株的长势有关。但总体上,双基因策略在青蒿素的合成调控中起着重要的作用,6个转基因株系在青蒿素含量和hdr和ads基因的表达量上都相对于野生型对照有所提高。说明双基因的遗传转化能够在一定程度上打破青蒿素生物合成途径中的限速反应步骤,推动代谢流更多的向目的产物青蒿素合成方向流动,提高青蒿素的合成能力,最终表现为青蒿素含量提高。hdr和ads基因分别是青蒿素上游MEP途径中的最后一个关键酶基因和下游合成途径第一个关键酶基因,二者的过量表达一方面能够为青蒿素的下游合成提供更为充足的前体物质同时能够高效转化来自于上游途径提供的代谢流,合成目的产物青蒿素。本研究的实验结果证明,过表达hdr和ads基因在黄花蒿的代谢途径中具有提高青蒿素含量的作用,为进一步利用代谢工程技术培育青蒿素高产转基因青花蒿提供了基础。