癌症是当今全球致死率最高的疾病之一,随着肿瘤耐药性的产生,临床一线用药很难有效杀灭患者体内的肿瘤细胞,达到预期治疗效果。因此,基于新机制、新靶点的抗肿瘤药物研发具有重大意义。众所周知,异常的细胞分裂是肿瘤细胞最显著的特征之一。Cdc25磷酸酶（cell division cyclin 25 phosphatase）是一种细胞分裂周期调控蛋白,其可促进肿瘤细胞的分裂与增值,并在多种肿瘤细胞中过量表达。因此,有效抑制Cdc25磷酸酶的活性可以有效抑制肿瘤细胞的分裂增殖。但现阶段还未有靶向于Cdc25磷酸酶的药物上市,因此靶向Cdc25磷酸酶的抗肿瘤新药研发具有重要研究价值。然而,Cdc25磷酸酶活性位点宽阔平坦且带正电荷,不利于小分子抑制剂的结合;同时,Cdc25磷酸酶三种亚型的催化域在进化过程中高度保守,不利于针对某种亚型的选择性抑制剂研发。所以,靶向Cdc25磷酸酶的高亲和力、高选择性抑制剂研发具有一定难度,曾一度被归类为“难成药靶标”之一。针对该“难成药靶标”,本论文综合运用基于片段的药物设计策略、微量合成和快速生物活性筛选技术、虚拟筛选等新技术、新方法来发现具有潜在活性与选择性的苗头或先导化合物,主要分为以下三部分:（Ⅰ）基于微量合成发现新型Cdc25磷酸酶抑制剂一般来说,药物研发需要多轮的化合物结构修饰和生物活性评价,该过程需要耗费大量的人力物力。如何快速构建兼具类药性与多样性的高品质化合物库成为新药研发中的瓶颈问题。基于微量合成构建片段组合库与快速筛选的策略综合了基于优势化合物片段的多样性合成理念、平行合成方法和快速生物活性筛选等新兴技术,已成为具有广阔应用前景的苗头或先导化合物发现的新技术。课题组前期以广泛报道的Cdc25磷酸酶醌类抑制剂NSC663284为先导化合物,提取其萘醌结构作为优势片段,利用CuAAC点击反应在该片段上引入结构和电性多样性的取代基,并通过快速抑酶活性筛选技术发现了 Cdc25C选择性抑制剂M2N12（Cdc25A:IC50=0.53±0.03 μM;Cdc25B:IC50=1.39±0.95 μM;Cdc25C:IC50=0.09±0.01 μM）。受此启发,本论文第二章继续对该萘醌优势片段进行结构改造,以期发现新型Cdc25磷酸酶选择性抑制剂,并进一步丰富该萘醌片段的构效关系（structure activity relationship,SAR）。据文献报道,萘醌类化合物的可能结合位点为催化位点。考虑到该位点富含苯丙氨酸和精氨酸,本章主要选取以芳环和芳杂环为母核且具有结构和电性多样性的叠氮片段和氨基片段构成优势片段库。而后,利用基于微量合成的模块化反应将优势萘醌片段与后期设计的优势片段两两组合,并通过TLC和LC-MS对反应进程实时监测。最终,本章快速构建了四个基于萘醌优势片段的聚焦型化合物库,共138个化合物。接着,通过快速筛选、扩大量合成与抑酶活性复筛发现了多个具有潜在开发价值的目标化合物。如化合物 M5N36（Cdc25A:IC50=0.15±0.05 μM;Cdc25B:IC50=0.19 ±0.06μM;Cdc25C:IC50=0.06±0.04 μM）,其对Cdc25磷酸酶的抑酶活性均优于阳性对照 NSC663284（Cdc25A:IC50=0.27± 0.02 μM;Cdc25B:IC50=0.42± 0.01 μM;Cdc25C:IC50=0.23±0.01 μM）。同时,对比该化合物对Cdc25磷酸酶三种亚型的抑酶活性,可以发现其表现出一定的Cdc25C亚型选择性。而后,本章挑选了多种Cdc5磷酸酶过量表达的肿瘤细胞株（如:三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231、乳腺癌细胞MCF-7和他莫昔芬耐药性的乳腺癌细胞MCF-TAM等）对目标化合物进行抗肿瘤细胞活性测试,实验结果表明,化合物M5N36在多种肿瘤细胞中表现出了与阳性对照相当的抗肿瘤细胞活性。其在三阴性乳腺癌细胞（MDA-MB-231）和淋巴瘤细胞（Raji）中活性最好,IC50值分别为2.00±0.81μM、1.20±0.47μM,与阳性对照NSC663284（MDA-MB-231:IC50=2.04±0.21μM;Raji:IC50=1.00±0.66 μM）相当。Western-blot 实验证明,M5N36在MDA-MB-231细胞中通过抑制Cdc25磷酸酶促使肿瘤细胞凋亡。随后,通过分子模拟对本章中的目标化合物结合模式与理化性质进行了预测。三个目标化合物均符合“类药五原则”,具有进一步开发的前景。（Ⅱ）基于优势萘醌片段的二聚体类新型Cdc25磷酸酶抑制剂发现前已述及,Cdc25磷酸酶活性位点宽阔且平坦,不利于小分子抑制剂的结合,但与其毗邻的“泳池位点”和相距20 （?）的底物识别位点空间较大且深,利于化合物的结合,同时,富含精氨酸、酪氨酸等,与活性位点氨基酸种类相似,因此利于萘醌优势片段的结合。基于以上对靶标结构的分析,提出针对Cdc25磷酸酶设计双位点结合抑制剂的思路,以期进一步提高抑制剂对Cdc25磷酸酶的亲和力。本论文第三章选取不同长度、柔性的链接基团（linker）将优势萘醌片段进行连接以期实现双位点抑制作用,从而发现抑酶活性优于先导化合物NSC663284的新型Cdc25磷酸酶抑制剂。同上,本章通过基于CuAAC点击反应的微量合成方法和快速筛选技术快速构建并完成了二聚体化合物库的抑酶活性测试。而后,通过扩大量合成与抑酶活性复筛发现了化合物M5N43（Cdc25A:IC50=0.14± 0.01 μM;Cdc25B:IC50=0.37± 0.06μM;Cdc25C:IC50=0.67±0.04 μM）,其对Cdc25磷酸酶的抑制活性均优于NSC663284（Cdc25A:IC50=0.82±0.07μM;Cdc25B:IC50=1.31±0.14 μM;Cdc25C:IC50=1.44±0.37μM）,并且对 Cdc25A的抑制活性接近NSC663284的6倍。然而不足的是,该化合物在肝癌细胞（A549）、三阴性乳腺癌细胞（MDA-MB-231）和乳腺癌细胞（MCF-7）中的抗肿瘤细胞活性均低于NSC663284,该现象可能是由于化合物理化性质不佳,难于透过细胞膜而引起。因此,本章继续通过分子模拟对目标化合物的结合模式、透膜性与理化性质进行了预测,为后续化合物设计与结构优化提供了思路与研究基础,同时也为二聚体类化合物抗肿瘤细胞活性较弱的现象提供了可能的解释。最后,本章通过western-blot、ROS测试和细胞周期阻滞实验对二聚体类代表性化合物的作用机制进行了确证,为后续Cdc25磷酸酶二聚体类抑制剂的研究提供了理论基础。（Ⅲ）基于计算机虚拟筛选发现新型非醌类Cdc25磷酸酶抑制剂至今,Cdc25磷酸酶抑制剂已被广泛研究了 20多年,最具代表性的Cdc25磷酸酶抑制剂依旧是醌类化合物,其在细胞内发挥抗肿瘤活性的同时,也可能产生过量的活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）氧化正常蛋白质中的半胱氨酸,具有潜在的毒性。因此,开发非醌类结构的新型Cdc25磷酸酶抑制剂具有重要意义。本论文第四章首先将Cdc25B磷酸酶底物——磷酸化苏氨酸/酪氨酸分别进行对接,并比对其与蛋白晶体结构中的结合磷酸基团的叠合程度来确定该虚拟筛选模型的可靠性。最终,成功构建了针对Cdc25B活性位点的虚拟筛选模型,其磷酸化苏氨酸/酪氨酸对接模型可与蛋白晶体结构中的结合磷酸基团完美叠合（RMSD=0.18）。而后,通过该筛选模型从384万个化合物中发现了两个具有潜在开发价值和全新骨架的Cdc25B选择性抑制剂Y11和Y19。两个化合物对Cdc25B表现出了一定的抑制活性。化合物Y11对Cdc25磷酸酶三种亚型的活性分别为Cdc25A:IC50＞500 μM;Cdc25B:IC50=156.30±7.19μM;Cdc25C:IC50＞500μM;化合物Y19对Cdc25磷酸酶三种亚型的活性分别为 Cdc25A:IC50＞500 μM;Cdc25B:IC50=1 18.85± 12.07 μM;Cdc25C:IC50＞500μM。在抗肿瘤细胞活性中,仅化合物Y19表现出了对A549细胞系较弱的抑制活性,其IC50值为 193.60±4.27μM。综上所述,本文围绕未满足的抗肿瘤药物临床需求,以肿瘤增殖过程中的重要调控蛋白Cdc25磷酸酶为靶标,将新技术、新方法和新理念有机结合、综合运用,成功发现了极具开发前景的Cdc25C选择性抑制剂M5N36和对Cdc25A抑酶活性超阳性对照5倍的二聚体类抑制剂M5N43。同时,本论文成功建立了基于Cdc25B磷酸酶的虚拟筛选方法,并利用该方法发现了两个具有全新骨架的非醌类苗头化合物,为药物开发奠定了物质基础,并为后续Cdc25B磷酸酶选择性抑制剂的发现提供了新思路。