【摘 要】
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厚壳贻贝（Mytilus coruscus）味道鲜美,富含多种人体所需的营养元素,是浙江沿海的优势养殖品种。厚壳贻贝中蛋白质含量高,可用于制备生物活性肽,提高其利用价值。课题组前期研究发现,以最优酶解条件（胰蛋白酶,温度37℃,酶解时间6 h,p H环境为8,加酶量2000 U/g,料液比1:12（g/m L））制备的厚壳贻贝肽（Mytilus coruscus peptides,MCP）具有较好
【基金项目】
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浙江省自然科学基金委员会资助课题 （No.LGN20D060002）；
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厚壳贻贝（Mytilus coruscus）味道鲜美,富含多种人体所需的营养元素,是浙江沿海的优势养殖品种。厚壳贻贝中蛋白质含量高,可用于制备生物活性肽,提高其利用价值。课题组前期研究发现,以最优酶解条件（胰蛋白酶,温度37℃,酶解时间6 h,p H环境为8,加酶量2000 U/g,料液比1:12（g/m L））制备的厚壳贻贝肽（Mytilus coruscus peptides,MCP）具有较好的体内外免疫调节活性,但其中发挥作用的具体肽序列仍然未知。因此,本研究在此基础上,将MCP依次经Sephadex G-25凝胶柱及RP-HPLC分离纯化,以巨噬细胞RAW 264.7的增殖活性为指标,选出活性最高的组分,并用LC-MS/MS法测定该组分中的具体肽序列。再通过测定巨噬细胞RAW 264.7的增殖活性及NO合成能力筛选出活性最佳的肽序列,探究该序列在细胞和动物体内的免疫调节作用,研究结果如下:（1）MCP经Sephadex G-25分离纯化后,得到两个洗脱峰:MCP-Ⅰ、MCP-Ⅱ。选择对巨噬细胞RAW 264.7的增殖率更高的组分MCP-Ⅱ,用RP-HPLC进一步分离纯化,得到MCP-Ⅱ-Ⅲ。将产物冻干,经LC-MS/MS检测后得到MCP-Ⅱ-Ⅲ中的具体肽序列,再通过测定对巨噬细胞RAW 264.7的增殖活性及NO合成能力的影响,筛选出其中活性最佳的肽序列LVVLGH（LH-6）。（2）LH-6对RAW 264.7细胞的体外免疫调节活性结果:LH-6在1-400μg/m L浓度范围内对细胞无毒性,在1-50μg/m L范围内活化巨噬细胞并提高了细胞的增殖功能,明显增强了巨噬细胞的吞噬作用,提升细胞合成NO的能力,以及细胞因子TNF-α,IL-6,IL-1β的分泌水平。Western blot实验结果表明LH-6显著增加了细胞中TLR4、My D88的蛋白表达,并且提高了IκBα,p65及p38,JNK,ERK蛋白的磷酸化水平,激活NF-κB p65的核转位。而分子对接结果说明肽序列LH-6和TLR4蛋白之间具有优异的结合能力,可以进一步为肽序列发挥免疫调节作用的机制提供理论基础。（3）LH-6对环磷酰胺诱导的免疫低下小鼠的体内免疫调节活性结果:LH-6可以恢复小鼠的体重和免疫器官指数,改善模型组小鼠的脾脏、胸腺组织学结构,并促进腹腔巨噬细胞的NO合成。LH-6还能提高脾淋巴细胞增殖水平,增强腹腔巨噬细胞吞噬中性红的能力并改善迟发型变态反应。此外,LH-6还能调节血清溶血素水平,提高血清中细胞因子TNF-α,IL-6,IL-1β及免疫球蛋白Ig A、Ig G、Ig M的含量,并通过改善自然杀伤细胞活性调节免疫低下小鼠的免疫机能。Western blot实验显示LH-6通过NF-κB信号通路,显著上调了免疫低下小鼠脾脏TLR4、My D88的蛋白表达,并且提高了IκBα和p65蛋白的磷酸化水平,同时促进了MAPK信号通路中的p38,JNK,ERK蛋白的磷酸化水平。本研究结果表明MCP经过分离纯化后得到的肽序列LH-6在体内外均具有良好的免疫调节活性,并有可能是通过激活TLR4介导的NF-κB/MAPK信号通路来实现的,为厚壳贻贝的高价值开发利用提供依据,为食源性免疫调节肽开发与研究提供新方向。
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