论文部分内容阅读
目的:在细胞水平上,探讨NMDAR1是否通过MMP2调控PD-L1的表达,影响Huh7细胞的侵袭和转移。方法:1.以LO2肝细胞系和Huh7肝癌细胞系为实验对象,首先利用PCR扩增,然后琼脂糖电泳检测两种细胞系中NMDAR1、PD-L1的基因型;ELISA进一步检测NMDAR1、PD-L1在上述细胞系中的蛋白表达水平,q RT-PCR检测其m RNA的表达;q RT-PCR和Western Blot检测上述细胞系中MMP2、TIMP2的m RNA及蛋白的表达水平;最后利用统计学方法分析结果。2.为了找到最佳给药浓度,首先利用CCK8实验检测NMDAR1激动剂(N-Methyl-D-aspartic acid,NMDA)、NMDAR1拮抗剂(Dizocilpine,MK-801)对Huh7细胞活力的影响。随后通过Graph Pad计算NMDA和MK-801两种药物的IC50值,以获得最佳处理浓度。3.用NMDA和MK-801分别处理Huh7细胞24h,并设立空白对照组Control,利用ELISA验证Huh7细胞中NMDAR1表达水平,q RT-PCR验证其m RNA的表达变化,旨在明确NMDA是否促进NMDAR1的表达,MK-801抑制NMDAR1的表达。4.用NMDA和MK-801分别培养Huh7细胞24h,并设立空白对照组Control,利用ELISA和q RT-PCR检测PD-L1的表达变化;利用Western Bolt和q RT-PCR技术检测MMP2、TIMP2蛋白和m RNA的表达差异,酶谱法观察不同条件下MMP2活性的变化,以求明确调控Huh7细胞内NMDAR1表达水平是否影响MMP2、TIMP2及PD-L1的表达及MMP2的活性。5.用MMP2拮抗剂BB2516(Marimastat,BB2516)培养Huh7细胞24h,并设立空白对照组Control,利用ELISA和q RT-PCR技术检测BB2516对PD-L1的表达变化影响,旨在观察BB2516是否抑制PD-L1表达。6.用NMDA,NMDA+BB2516,MK-801处理Huh7细胞24h,并设立空白对照组Control,利用ELISA和q RT-PCR实验检测PD-L1表达变化,以求观察Huh7细胞内NMDAR1对PD-L1表达所产生的影响是否因拮抗MMP2而变化。7.将实验分为空白对照组Control,NMDA,NMDA+BB2516和MK-801四组,通过以下实验明确NMDAR1表达水平的变化是否通过MMP2-PD-L1影响Huh7细胞的增殖及运动能力:(1)CCK8实验分别检测Huh7细胞处理6h和24h后增殖能力;(2)细胞划痕实验检测细胞6h和24h的愈合能力;(3)Transwell实验检测细胞24h的侵袭和迁移能力。结果:1.2%琼脂糖凝胶电泳证实LO2和Huh7细胞中均有NMDAR1、PD-L1基因型。与LO2正常肝细胞相比较,Huh7肝癌细胞中NMDAR1、MMP2、PD-L1的表达水平均增加,(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001),且NMDAR1表达影响MMP2、PD-L1的表达。而Huh7肝癌细胞中TIMP2的的表达水平减少,且NMDAR1不影响TIMP2表达。2.NMDA、MK-801加入Huh7细胞中培养24h后,CCK8实验结果表明24h后上述药物随着给药浓度增加存活率逐渐下降。NMDA处理浓度为5μM、10μM、20μM、100μM时细胞活力分别为(93±0.90)%、(73.63±3.7)%、(61.55±1.49)%和(28.5±1.84)%;MK-801处理浓度为50μM、100μM、200μM、500μM时,细胞活力分别为(93.3±2.77)%、(81.77±2.98)%、(52±3.11)%和(27.8±2.41)%。其中,NMDA处理浓度为20μM、100μM时差异有极显著统计学意义(***P<0.001);MK-801处理浓度为200μM、500μM时,差异极显著,有统计学意义(***P<0.001)。最后根据NMDA和MK-801两组细胞存活率,通过Graph Pad计算NMDA和MK-801两种药物的IC50值为37.83±0.35μM和238.8±2.8μM。3.给予NMDA于Huh7细胞培养24h后,NMDAR1表达上调,伴随着MMP2蛋白和m RNA表达上调(*P<0.05,**P<0.01),且酶谱法表明MMP2活性也增加;此外,ELISA和q RT-PCR结果显示PD-L1表达上调,且随着NMDAR1表达增多,PD-L1表达也增多(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。相反,给予MK-801于Huh7细胞培养24h后,NMDAR1表达下调,同时伴随着MMP2蛋白和m RNA表达下调,酶谱法表明MMP2活性降低;此外,ELISA和q RT-PCR结果显示PD-L1表达下调。4.给予BB2516(1μM,6μM)于Huh7细胞培养24h后,q RT-PCR和ELISA实验结果表明,PD-L1表达均下调,而且BB2516 6μM较1μM,PD-L1表达水平下调更多(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。此外,NMDA+BB2516组的PD-L1表达水平低于NMDA组,提示BB2516抑制MMP2干扰了NMDAR1对PD-L1的表达调控。5.空白对照组Control,NMDA组,NMDA+BB2516组,MK-801组处理Huh7细胞。实验结果证明:24h后NMDA组增殖能力明显增强(*P<0.05),划痕面积明显大于空白对照组Control和MK-801组(*P<0.05);细胞迁移、侵袭实验发现,与空白对照组Control和NMDA组相比,MK-801组迁移和侵袭的细胞数量明显降低(**P<0.01,*P<0.05);重要的是,NMDA所产生的上述效应可被BB2516所抑制,即NMDA+BB2516迁移和侵袭的细胞数量介于control和NMDA组之间(**P<0.01,***P<0.001)。结论:Huh7肝癌细胞中NMDAR1高表达,但拮抗NMDAR1表达可降低MMP2表达,进而降低PD-L1表达,抑制肝细胞癌侵袭和迁移。