地西他滨(Decitabine,DAC),化学名称为5-氮杂胞嘧啶脱氧核苷,是一种去甲基化药物,具有独特的甲基化转移酶抑制剂的治疗机制。地西他滨能诱导细胞死亡,阻止DNA合成,特别是它能有效地去除DNA甲基化,从而使许多失活的基因重新表达。地西他滨于2006年5月由美国FDA批准上市,用于原发性和继发性骨髓增生异常综合征(MDS)的治疗药物,现今,治疗急性髓性白血病的研究已进入Ⅲ期临床。本文对地西他滨体外抑制黑色素瘤细胞增殖及其分子机制进行探讨,在此基础上进行了地西他滨长循环温度敏感脂质体剂型的实验研究。研究的主要内容包括:(1)地西他滨体外抗黑色素瘤作用及其机理研究;(2)地西他滨长循环温度敏感脂质体处方前研究;(3)地西他滨长循环温度敏感脂质体制备及其理化性质研究;(4)地西他滨长循环温度敏感脂质体的药动学研究;(5)地西他滨长循环温度敏感脂质体体内外抗肿瘤作用研究五个部分。本文采用四甲基偶氮唑盐染色(MTT)法测定地西他滨体外抑制黑色素瘤细胞生长增殖,抑制作用具有浓度和时间依赖关系,流式细胞测定结果表明地西他滨可将黑色素瘤K1735M2细胞阻断于G2/M期;地西他滨能诱导黑色素瘤K1735M2细胞形态分化,形成长的树突状结构,并且细胞这种形态的改变是不可逆的,地西他滨可以抑制K1735M2黑色素瘤细胞恶性表型;虽然地西他滨在一定程度上可以引起K1735M2黑色素瘤细胞凋亡,但凋亡率保持在一个较低水平;Werstern blot试验结果表明,K1735M2黑色素瘤细胞经地西他滨处理后,未能上调p53和p21蛋白表达量。因此,地西他滨能够诱导细胞分化和细胞周期阻滞而非细胞凋亡是其抑制鼠K1735M2黑色素瘤细胞体外增殖可能的重要机制。本文建立了地西他滨长循环温度敏感脂质体含量测定的HPLC方法,灵敏度高,重现性强,同时,建立了微柱离心法用于测定地西他滨脂质体包封率。地西他滨化学性质不稳定,易水解,有机溶剂甲醇的加入,可以延缓地西他滨溶液长时间放置过程中地西他滨的水解,有助于溶液稳定性;同时较低的温度,可以延缓地西他滨水解的时间。测定地西他滨在PBS缓冲液中的表观溶解度为19.19mg/ml,地西他滨正辛醇/水表观分配系数为-0.81,该数据为地西他滨脂质体的制备奠定基础。采用逆向蒸发法制备地西他滨长循环温度敏感脂质体(DAC-LTSL),在单因素考察的基础上,采用正交试验法优化处方及制备工艺,脂质体药物平均包封率为44.5%,脂质体的平均粒径为140.2±2.4nm。采用Delsa 440 SX Zeta电位仪测定DAC-LTSL电位值,测得结果为-8.34 mV;采用透析法考察脂质体体外释放规律,结果表明,DAC-LTSL在高于42℃条件下可释放绝大部分药物,地西他滨长循环温度敏感脂质体的相变温度在42～43 ℃之间,略高于DPPC磷脂的相变温度。以冻干制剂的外观、水化复溶情况及水化后脂质体粒径为指标,筛选冻干保护剂,制备了地西他滨长循环温敏脂质体冻干粉剂,并以包封率及粒径为指标,优化了地西他滨长循环温度敏感脂质体冻干曲线,冻干脂质体重建后的平均包封率在40%左右,平均粒径在150±15nm范围内,略大于冻干前脂质体粒径。此外,对冻干脂质体进行了影响因素及1个月的稳定性考察,地西他滨脂质体对高温及光照敏感,在遮光、密闭凉暗处(避光不超过20℃)放置30天,外观色泽未有明显变化,药物包封率略有下降,粒径略有增加,与未冻干脂质体相比较,可以增加其制剂贮存稳定性。本文建立了 LC/MS/MS联用法测定地西他滨和地西他滨长循环温度敏感脂质体经静脉注射给药后在大鼠体内的血药浓度,并绘制出血药浓度-时间曲线。根据血药浓度-时间数据,采用梯形法计算AUC0-t值,以半对数作图法,由消除相末端的浓度点计算t1/2,用DAS 2.0药代动力学软件对主要药动学参数进行平行设计实验的差异分析。本文考察地西他滨长循环温度敏感脂质体体外抑制黑色素瘤K1735M2细胞增殖的作用。结果表明,地西他滨温度敏感脂质体能体外抑制肿瘤细胞生长增殖,具有浓度和时间依赖关系,不加热情况下作用强度与地西他滨相比未出现明显差异;DAC-LTSL可将黑色素瘤K1735M2细胞阻断于G2/M期,并能诱导细胞形态分化,形成长的树突状结构。动物实验研究结果表明,地西他滨长循环温度敏感脂质体结合热疗有较好的抑瘤作用,其作用效果强于地西他滨溶液,显示DAC-LTSL具有良好的热靶向性。