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帕金森病(Parkinson’sdisease,PD)是最为广泛的神经退行性疾病之一,近年来对此疾病的研究越来越受到人们的重视。α-synuclein是synuclein蛋白家族成员之一,由140个氨基酸编码组成,主要在脑组织中大量表达,是Parkinson病中特征性路易小体的主要组成部分。α-synuclein蛋白的聚集状态的变化可能是影响帕金森病发生一个关键因素,而α-synuclein蛋白结构的转变受到许多遗传学与细胞学因素的影响。确定影响α-synuclein蛋白聚集的因素,明确α-synuclein存在的不同状态以及在蛋白聚集过程中的相互关系,有助于人们最终在分子细胞水平上揭示帕金森病及其它神经退行性疾病的发生机制,寻找治疗帕金森病更为有效的途径。细菌表面展示技术的提出和广泛应用为α-synuclein的细菌表面正确折叠展示和靶分子的筛选及研究提供了重要的技术平台和条件。
本文首先采用生物信息学手段对不同物种synuclein蛋白进行序列比对,构建分子进化树,亲缘关系分析;同时对人α-synuclein野生型蛋白及突变体A30P、E46K和A53T的二级结构,三级结构以及疏水性进行分析;在此基础之上,采用叠套PCR(overlapextension PCR)介导的点突变方法,以野生型α-synuclein为模板,克隆α-synucleinA30P、E46K和A53T3个突变型基因和采用PCR介导的连接方克隆α-synuclein剪接变体98,112和126;利用细菌亲密素展示系统paskint100对野生型α-synuclein及其突变体A30P、E46K和A53T进行细菌表面的展示,并采用SDS-PAGE凝胶电泳和WesternBlot对外源蛋白α-synuclein进行检测和确定;最后利用展示在大肠杆菌细胞表面的α-synuclein筛选噬菌体随机12肽库,筛选与α-synuclein高度亲和的特异性多肽分子。
进化分析结果表明:synuclein家族蛋白可以聚为3类,各物种的α、β和γ各聚成一类。α-synuclein、β-synuclein和γ-synuclein属于直系同源基因;而相同物种的α、β和γ-synuclein由基因复制而产生,属于旁系同源基因,与直系同源的α-synuclein、β-synuclein和γ-synuclein基因相比则表现出较远的距离。通过生物信息学分析发现人类α-synuclein蛋白可以从序列上分为3个区域:N端(1-60)的两性α螺旋区,主要包括膜结合区和疏水性NAC区,主要由6个“KTKEGV”非完全重复序列组成;中间NAC(61-95)区域表现出较强的疏水性;C端(96-140)则主要由酸性氨基酸组成。α-synuclein突变体A30P、E46K和A53T的突变位点位于α-synuclein基因的不同外显子上。突变体A30P的88位突变碱基位于外显子2上;而突变体E46K和A53T的突变位点则位于外显子3。α-synuclein外显子的异位拼接产生4种异构体。5个外显子都参与编码一个由140个氨基酸组成的14.5kDa的蛋白,这是α-synuclein在人体内存在的主要形式;同时外显子3和5在体内存在选择性剪接的机制,外显子3或5的缺失,分别形成与140个氨基酸α-synuclein同框的126个氨基酸(13.1kDa),112个氨基酸(11.4kDa)的剪接变体;而外显子3和5的同时缺失则形成一个只编码98个氨基酸的α-synuclein。
其次,采用叠套PCR介导的点突变方法和连接方法,以野生型α-synuclein为模板,成功获得了α-synucleinA30P、E46K和A53T3个突变型基因以及α-synuclein剪接变体98,112和126。
第三,以GFP为模型蛋白通过paskin100重组质粒的构建和细菌表面展示、GFP蛋白诱导表达和绿色荧光显示确认细菌亲密素展示系统的正确性。在此基础上将野生型α-synuclein及突变体A30P、E46K和A53T成功展示在大肠杆菌的细胞表面,SDS-PAGE凝胶电泳和WesternBlot检测到外源α-synuclein蛋白目的带的高效表达。
第四,利用展示在大肠杆菌表面α-synuclein筛选噬菌体随机12肽库,筛选与α-synuclein高度亲和的特异性短肽,经前两轮的筛选,已收获与α-synuclein结合的噬菌体肽库,正用于进一步的筛选和富集。
综上,通过本研究得到如下初步结论:1)synuclein直系同源基因α-synuclein、β-synuclein和γ-synuclein基因表现为较近的亲缘关系,而相同物种由基因复制产生的旁系同源基因α、β和γ-synuclein则表现出较远的距离;2)生物信息学分析发现人α-synuclein蛋白从序列上可分为3个区域:N端(1-60)的两性α螺旋区;中间NAC(61-95)区:C端(96-140);3)突变体A30P、E46K和A53T的突变位点位于不同的α-synuclein基因的外显子上;4)外显子3或5的缺失,分别形成与140个氨基酸α-synuclein同框的126个氨基酸(13.1kDa),112个氨基酸(11.4kDa)的剪接变体,而外显子3和5的同时缺失则形成一个只编码98个氨基酸的α-synuclein。不同突变和剪接形式的α-synuclein对α-synuclein蛋白的聚集速度存在一定的影响;5)通过叠套PCR介导的点突变和连接方法成功克隆α-synuclein突变型基因A30P、E46K和A53T及剪接变体98,112和126;6)通过GFP重组质粒的构建和细菌表面展示确认了细菌亲密素展示系统的正确性,实现了α-synuclein及其突变体的细菌表面展示并直接用于噬菌体随机肽库的筛选。本工作对基亍α-synuclein及其突变体靶分子结合肽的获得和帕金森病等神经退行性疾病的研究和治疗均具有重要的意义和价值。