荆州黑麦染色体特异分子标记的开发与应用

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荆州黑麦(Secale cereale cv.Jingzhouheimai)是小麦抗白粉病改良的重要基因资源。为了解白粉菌诱导后荆州黑麦相关基因的表达特点、开发更多荆州黑麦染色体特异标记,本实验室前期研究对白粉菌诱导前后的荆州黑麦进行了转录组分析,获得70,705条非冗余序列,拼接成46,810条contigs,获得了 3,197条诱导后上调表达基因。本研究对这些序列的SSR组成进行了分析,开发分子标记,对筛选出的特异标记进行了染色体定位,并将这些标记应用于异染色体系的辅助选择,主要结果如下:利用 MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)对 70,705 条非冗余序列进行SSR分析,其中11,904条(占16.84%)含SSRs,共鉴定出16,697个SSRs,平均每2.37 kb 出现 1 个 SSR。8,660 条(72.75%)仅含 1 个 SSRs,3,244 条(27.25%)至少含2个SSRs,2,240个SSRs以复合形式存在。分析发现三碱基重复单元出现次数最多(9,593次、占57.45%),其中CCG/CGG(3,289次)为数量最多的三碱基基序。从长度分布来看,长度为12 bp的SSR数量最多,有9,810个(58.75%),其次为15 bp(3,090个、占18.50%),超过25bp的SSR最少,仅有31个(0.20%)。结合前期研究,利用转录组数据总计合成4类874对引物,包括176对SSR引物(第Ⅰ类)、148对PLUG引物(第Ⅱ类)、237对根据与小麦D基因组序列比对没有相似性的序列设计的引物(第Ⅲ类)和313对根据与NCBI的非冗余核苷酸数据库比对没有相似性的序列设计的引物(第Ⅳ类利用辉县红、荆州黑麦和辉县红-荆州黑麦双二倍体荆辉1号对这些引物进行了扩增分析,除88对引物无扩增外,从786对引物中筛选出307对引物扩增出403个荆州黑麦特异位点,包括87对第I类引物、42对第Ⅱ类引物、80对第Ⅲ类引物和98对第Ⅳ类引物,多态率为39.06%。将其中168个标记定位于1R-7R染色体,分别为1R 10个、2R22个、3R 17个、4R 39个、5R 19个、6R 25个和7R 9个,另外27个标记在两条及以上染色体上具有重复位点。利用定位于5R染色体上的9个标记(包括2个前人报道的标记)对DtA5RS和中国春ph1bph1b突变体/MA5R的F4群体进行分析,6个单株涉及4-8个标记的缺失,结合细胞学分析鉴定出1个单株含有5RL端体,将6个标记位于5RL、3个标记定位于5RS;综合标记分析和细胞学鉴定,选育出10个涉及1R和7R的异染色体系或变异体,进一步证明了标记辅助选择在染色体工程中的有效性。
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