自从上个世纪的青霉素工业化生产以来,到目前已开发了上千种抗菌素,并广泛应用于感染性疾病防治,取得显著的效果,在医学界曾以为有了抗菌素就彻底解决了感染性疾病防治问题.但随着抗菌素的大量使用和滥用,抗菌药物治疗所引起的非感染部位微生态菌群失常而导致的疾病,如伪膜性肠炎、阴道炎等疾病给人类造成了很大的危害.如果能及时分解或灭活进入这些非感染部位的抗菌素,则可以避免或减少这种疾病.抗菌素伴侣的概念,就是可以清除在接受抗菌素治疗时进入非感染部位的抗菌素,从而保护非感染部位正常菌群和微生态平衡的制剂. 本研究课题从反向思维考虑,目的在于将严重影响抗菌药物防治效果的抗菌素耐药酶开发成为抗菌素伴侣.目前认为,细菌对抗菌素耐药的机制大多是细菌产生了能分解或灭活抗菌素的酶,如β-内酰胺酶、氨基糖苷类修饰酶等.利用耐药酶灭活相应抗菌素的特性,使到达非感染部位的抗菌药物浓度得到减少或清除,从而使这些微生态区域(如肠道、阴道等)的正常微生物群避免遭抗菌药物的作用,从而达到保护人体微生态环境正常菌群的目的. 本实验作为研究课题的一部分,主要研究了细菌对氨基糖苷抗生素耐药机制中最常见和最重要的氨基糖苷类修饰酶--氨基糖苷乙酰转移酶(3)-Ⅱ(从C(3)-Ⅱ).在第一部分作为临床基础性研究,主要分析了从临床分离的大肠埃希菌的耐药谱,为临床治疗提供相应的实验室资料和为本科题提供临床资料;在第二部分以aac(3)-Ⅱ基因为研究对象,将该基因克隆到载体pET26b中表达;同时将aac(3)-Ⅱ基因和tem-116基因用一柔性肽连接后表达,以研究融合酶的活性;采用分子进化技术定向进化aac(3)-Ⅱ基因以提高其活性,为进一步提高酶活的研究以及新型抗生素的研发作相应的基础工作. 通过上述实验,我们得到如下结果:①54株大肠埃希菌对阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、链霉素、大观霉素和奈替米星的耐药率分别为14.8﹪、77.8﹪、59.3﹪、66.7﹪、68.5﹪、61.1﹪、22.2﹪;共检测出产ESBLs菌株34株,占63.0﹪.耐氨基糖苷类抗生素的大肠埃希菌与其产ESBLs有相关性,从而表现出多重耐药性.②aac(3)-Ⅱ基因在54株大肠埃希菌中检出率为88.5﹪;重组菌BL2l(DE3)/pET26::aac(3)-Ⅱ对庆大霉素有耐药性,而对其余争5种氨基糖苷类抗生素没有表现出耐药性.③融合基因重组菌BL21(DE3)/pET28::aac(3)-Ⅱ/tem-116与aac(3)-Ⅱ基因重组菌均只对庆大霉素和卡那霉素耐药;对β-内酰胺类抗生素的耐药性中,融合基因重组菌与tem-116基因重组菌的耐药谱没有差别,因此融合基因aac(3)-Ⅱ/tem-116表达的融合蛋白酶具有双酶活性,并且与天然的单一基因酶相比,在活性上没有差别.④通过易错聚合酶链反应的方法,对aac(3)-Ⅱ基因进行体外进化,经过两次的易错PCR,获得一突变株,其活性与原始野生株相此提高了4～5倍. 以上研究表明:(1)第一部分中,分析了大肠埃希菌对7种氨基糖苷类抗生素的耐药性和菌株产ESBLs的相关情况,对于临床上使用抗生素有一定的指导性意义,并且为本科题提供了相应的临床应用资料.(2)第二部分中,分析了aac(3)-Ⅱ的相关性质,并成功地将aac(3)-Ⅱ与tem-116融合和表达,为研究和开发具有双酶活性的融合酶奠定基础;同时探讨和运用分子进化技术对aac(3)-Ⅱ基因进行改造以提高其活性,也为今后相关的工作以及新型抗生素的研发作了技术上的基础.