非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的一种具有高度传染性的疾病。该病在世界范围内造成了严重的经济损失,尤其是对中国养猪业的影响。目前,没有针对ASFV的疫苗或治疗方法,防控仍然是主要策略。2021年11月中国动物疫病控制中心印发了《养殖场非洲猪瘟病毒变异株防控技术指南》,指南中明确表示在我国已经出现了非洲猪瘟病毒变异株,其中包括MGF360-505R基因缺失株。本研究拟以ASFV MGF360基因为靶基因分别进行了荧光定量PCR方法,及基于MGF360-13L蛋白间接ELISA检测方法的建立。为开发ASFV诊断试剂盒及其结构和功能奠定了基础。1.ASFV MGF360基因荧光PCR方法的建立本研究基于ASFV MGF360基因设计引物和TaqMan探针,以人工合成的含有MGF360基因扩增片段的质粒为模板,所建立的方法在1.8×10~1copies/μL～1.8×10~7 copies/μL的质粒浓度范围内表现出良好的线性关系。标准曲线的扩增效率为101.9%,相关系数（R~2）为1.000,批内批间试验变异系数（CV）均小于3%。与其他病毒的核酸无交叉反应,说明该方法具有良好的特异性。本研究建立的ASFV实时PCR检测方法的最低检测限为1.8×10~1 copies/μL,该方法特异性和灵敏度高,分析变异系数低（小于3%）,为ASFV快速检测提供了技术储备。2.ASFV MGF360-13L蛋白的生物信息学分析和原核表达本研究预测了ASFV MGF360-13L蛋白的理化性质、蛋白质二级结构,分析其疏水和亲水性,信号肽、跨膜位点、潜在磷酸位点、亚细胞定位以及蛋白抗原性。分析结果显示,MGF360-13L蛋白质二级结构包括α螺旋、β折叠、无规则卷曲和延伸链,具有亲水性,在该蛋白中发现有9个潜在的B细胞抗原表位和25个潜在磷酸化位点。对ASFV MGF360基因进行人工合成,并构建表达载体p ET-32a-MGF360,转化大肠杆菌BL21进行原核表达,优化诱导条件并进行重组蛋白纯化鉴定。结果显示,将重组蛋白命名r MGF360蛋白,该蛋白大小为49.7 KD,以包涵体形式存在,最佳诱导条件为30℃,IPTG诱导终浓度1.0m M,诱导时间8 h。Western-blotting分析表明rMGF360蛋白表达正确。3.ASFV MGF360蛋白间接ELISA方法的建立以纯化的r MGF360蛋白为包被抗原,建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法。结果显示,当r MGF360蛋白包被浓度为2μg/m L,血清样品稀释倍数为1:10,酶标二抗最佳稀释倍数为1:4000,TMB底物显色时间为15 min时为间接ELISA方法的最佳试验条件。阴阳临界值为OD450nm≥0.26。特异性试验表明,开发的检测方法不会与其他相关猪病毒如PRRSV、PCV2、CSFV、PRV和FMDV的抗体发生交叉反应。重复性试验结果表明,批内和批间重复试验的变异系数（CV）均小于10%。结果表明本研究建立的间接ELISA具有良好的重复性和特异性,与商品试剂盒的符合率为94%（94/100）。可应用于临床血清样本中ASF抗体的检测,及野毒株与变异毒株的鉴别。