【摘 要】
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为了探讨利用毛状根技术来生产美洲商陆药用成分商陆皂苷甲的可能性,本文利用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)ATCC15834对美洲商陆叶片外植体进行遗传转化,获得了可快速
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为了探讨利用毛状根技术来生产美洲商陆药用成分商陆皂苷甲的可能性,本文利用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)ATCC15834对美洲商陆叶片外植体进行遗传转化,获得了可快速自主生长的美洲商陆毛状根系,并筛选出生长速度快、商陆皂苷甲含量高的优质株系。其结果如下:
美洲商陆叶片外植体被发根农杆菌ATCC15834感染约18d后,从其叶片外植体形态学下端叶脉切口处产生毛状根,其中以预培养1d,农杆菌感染20 min,共培养4d时的毛状根诱导率最高,达到70%。将所产生的毛状根切下并置于MS+500 mg/L头孢噻肟钠培养基上除菌培养后,共获得18个具有不同生长形态的美洲商陆毛状根根系A-R。
Ri质粒rolC基因的PCR扩增结果证实,发根农杆菌Ri质粒的T-DNA部分已在18个美洲商陆毛状根根系的基因组中整合和表达。所获得的18个美洲商陆毛状根系都能在无外源激素的MS固体培养基上快速自主生长;其表面密被白色根毛;其中以毛状根根系G和J生长速度相对较快,以毛状根根系O生长最慢;以毛状根根系Q最纤细,而以毛状根根系M最粗;以毛状根根系Ⅰ的分生侧根能力最强和根表面的根毛密度最高;其中毛状根根系A、B、F、H、I、J、O和P的根表面呈紫红色;而毛状根根系C、D、E、G、K、L、M、N、Q和R的根表面则呈白色。
取生长速度最快的美洲商陆毛状根根系G和J置于MS、1/2MS、B5和6,7-V液体培养基中进行离体培养后发现,以MS培养基最适合美洲商陆毛状根的生长;且根系G和J在MS液体培养基中的生长曲线均呈“S”型,依次经历0-5 d的停滞期,5-20 d快速生长期和20-25d的平台期。
商陆皂苷甲含量的HPLC测定结果表明,所获得的18个毛状根根系的商陆皂苷甲含量均比美洲商陆自然根的商陆皂苷甲含量高,其中以毛状根根系H的商陆皂苷甲含量最高,液体培养20 d后,其商陆皂苷甲含量达到1.63%,约为对照(非转化自然根)含量的10.87倍。与液体MS培养基相比,6,7-V培养基更有利于毛状根中商陆皂苷甲的合成与积累。
将商陆皂苷甲含量最高的商陆毛状根根系H置于MS+2.0mg/L2,4-D+0.5mg/L NAA的培养基20 d后,能形成浅绿色或浅紫红色的愈伤组织,将该愈伤组织转至MS+2.0 mg/L6-BA+0.2 mg/L NAA的培养基中培养20 d后,再转至MS+3.0 mg/L6-BA+0.03 mg/L NAA中进行培养20 d后,已形成具有芽点的愈伤组织。
本文所建立的发根农杆菌对美洲商陆的遗传转化体系以及所筛选到得生长快、药用成分商陆皂苷甲含量高的毛状根系,为今后利用该毛状根株系的规模培养来生产其药用有效成分商陆皂苷甲奠定了实验和技术基础。
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