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幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是人类胃病的重要病原体之一,是一种可长期定植于人类胃粘膜的革兰阴性螺旋形微需氧菌。目前,全球感染率已达到50%。已经证实,患有慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌和胃粘膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤等的多种胃肠道疾病皆与H.pylori感染密切相关。I型H.pylori菌株因携带cag致病岛(cag pathogenicity island,cag PAI)而致其毒性较强。幽门螺杆菌的重要毒力因子-细胞毒素相关基因A蛋白(Cytotoxin-associated gene A,CagA)被合成并通过致病岛编码的IV型分泌系统合成并转运进入宿主细胞内,导致细胞功能紊乱。目前,已知致病岛由27个基因组成,编码27种蛋白,但大多数基因的功能和发病机制尚未完全明确。本文以cagL基因作为研究对象,利用生物信息学方法预测其功能,并通过微生物学、分子生物学和免疫学等技术验证其功能,为进一步研究cag致病岛的功能和致病机制奠定基础。方法:1.用在线服务器及软件计算CagL的各种理化参数,分析其重复序列、疏水性曲线、抗原性曲线、进化树;进行氨基酸序列对比,分析Cag L信号肽和剪切位点及其跨膜螺旋和卷曲螺旋情况;用预测算法预测其二级结构和三级结构并搜索Cag L功能位点,分析其可能存在的功能。2.根据Gen Bank公布的H.pylori全基因组序列,将构建cagL基因缺失株的自杀质粒pBluescript/△cagL::KMr连接好后,进行酶切鉴定;收取H.pylori,加入自杀质粒,培养72 h,收取细菌。收获细菌经尿素酶以及细菌染色鉴定后,,提取细菌基因组DNA以野生株11637为对照进行鉴定。胃癌上皮细胞常规培养2~3d后,将野生型和cagL基因缺失株,分别与GES-1细胞共培养;细胞裂解后进行Western blot分析。3.收集2014年1月到2017年10月江苏大学附属医院手术送检的胃镜组织、肠镜组织、消化道肿瘤组织和消化道其他病变组织共158例,利用免疫组织化学染色实验,确定CagL在各种组织中的表达情况。结果:1.Cag L是一个保守蛋白;CagL蛋白不存在信号肽;Cag L蛋白有中三个功能位点,即蛋白激酶C磷酸化作用位点、酪蛋白激酶II磷酸化位点和豆蔻酰化作用位点。2.经酶切后,电泳图下方出现约为651 bp片段及电泳图下方出现约666 bp片段。PCR鉴定结果表明,野生株获得了约为2kb的片段,而基因缺失株获得了一约2.5kb大小片段。cagL基因缺失株作用组与阴性对照组均未能检测CagA蛋白。3.通过病理医师镜检,不同病变的消化道上皮细胞膜、腺体均呈阳性。结论:1.成功获得了cagL基因序列,并对其进行了同源性分析,并预测出CagL的二级、三级结构形态及功能位点。2.成功构建了自杀质粒pBluescript/△cagL::KMr,获得了一株cagL基因缺陷株;证明了cagL基因缺失能导致CagA蛋白转运功能丧失。3.明确了CagL蛋白位于菌体的外膜部位及在消化道组织中的表达。