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随着国际贸易的发展,观赏鱼的进出口已经成为我国渔业发展的重要组成部分,而锦鲤（Cyprinus carpio haematopterus）是我国观赏鱼主要养殖品种,自1997年德国爆发锦鲤疱疹病毒病（KHVD）以来,至今已经有30多个国家和地区陆续有该病的报导,给锦鲤养殖业带来严重的破坏,CyHV-3是该病的主要病原。因此,为了预防KHVD的爆发,需要建立有效、快速的检测方法。目前针对CyHV-3的免疫学检测方法已有多种,通过制备CyHV-3的全病毒单克隆抗体,可为建立CyHV-3免疫学检测方法提供多个靶点,为CyHV-3简单、快速检测提供技术支持。此外,CyHV-2能引发疱疹病毒性造血器官坏死病,给鲫鱼养殖产业带来不可估量的损失,由于CyHV-3与CyHV-2同源性达到81.55%,通过制备CyHV-3与CyHV-2交叉单克隆抗体,能够为同时检测CyHV-3与CyHV-2的免疫学检测方法的建立提供技术支持。最后通过筛选效价较高的单克隆抗体,利用免疫胶体金技术研制出CyHV-3免疫检测试纸条,能够现场简单、快速检测CyHV-3。本研究分离提纯了CyHV-3病毒粒子,制备了CyHV-3全病毒单克隆抗体以及CyHV-3和CyHV-2交叉单克隆抗体并进行功能鉴定,初步研制了CyHV-3胶体金免疫检测试纸条。研究主要由以下三个方面组成:（1）利用CyHV-3-GZ1301毒株去感染鲤鱼脑细胞系（CCB）,收集大量病毒感染液,通过蔗糖密度梯度超速离心对CyHV-3病毒进行纯化。将纯化CyHV-3免疫4周龄雌性BALB/c小鼠,免疫4次后将小鼠脾细胞与SP2/0瘤细胞进行融合,采用Dot-blot法筛选阳性细胞株,Western-blot验证阳性细胞株,用筛选的阳性细胞株进行腹水制备并用Dot-blot法检测腹水效价,用筛选出来的单克隆抗体检测感染CyHV-3的CCB细胞。结果显示:感染CyHV-3的CCB细胞在第6天开始收缩变圆,出现空泡,呈典型的细胞病变效应。在蔗糖密度梯度为40%～50%和50%～66%下收集大量的CyHV-3病毒,透射电镜下观察到了纯化的CyHV-3病毒粒子。对Dot-blot法筛出的阳性细胞株进行亚克隆、转孔扩大培养,通过Western-blot法筛选出5株能与CyHV-3有特异性反应的阳性细胞株,分别为1G6,2A11,3D2,4B9,4E10。其腹水效价分别为2A11的效价为1:10000;3D2的效价为1:10000;4B9的效价为1:10000;4E10的效价为1:20000。通过免疫荧光检测感染CyHV-3的CCB细胞结果显示:1G6,2A11,3D2,4B9,4E10株抗体能够检测到CCB细胞中的CyHV-3,呈现绿色荧光信号。本研究制备了CyHV-3全病毒单克隆抗体,为CyHV-3免疫学检测方法的建立提供更多的抗体靶点。（2）用本实验室保存的CyHV-2-YC01株感染异育银鲫尾鳍细胞系（GiCF）,收集大量的病毒感染液,进行蔗糖密度梯度超速离心获得纯化CyHV-2病毒。对融合细胞进行滴板,采用Dot-blot法和Western-blot法筛选能同时与CyHV-3与CyHV-2反应的阳性细胞株,进行抗体亚型检测,制备腹水检测腹水效价,运用细胞免疫荧光检测感染CyHV-3的CCB细胞和感染CyHV-2的GiCF细胞。其结果显示:一共筛选出6株能同时与CyHV-2和CyHV-3反应的阳性细胞株,分别是3E11,Ig G3型,4E4,Ig G2a型;4F4,Ig M型;2B4 Ig G1型;2C8 Ig G1型;2D11Ig G1型。其腹水效价为2B4在CyHV-3病毒中的效价为1:80000在CyHV-2病毒中的效价为1:160000;2C8在CyHV-3病毒中的效价为1:40000,在CyHV-2病毒中的效价为1:40000;2D11在CyHV-3病毒中的效价为1:160000,在CyHV-2病毒中的效价为1:40000。在细胞免疫荧光检测中,3E11、4E4、4F4均能检测感染CyHV-3的CCB细胞和感染CyHV-2的GiCF细胞。本研究制备的CyHV-3和CyHV-2的交叉抗体能够为CyHV-3和CyHV-2的免疫学检测方法的建立提供更多的理论依据。（3）为了制备效价较高的CyHV-3全病毒单克隆抗体,再一次对融合细胞进行滴板,采用Dot-blot法和Western-blot法和细胞免疫荧光筛选能与CyHV-3特异性反应的阳性细胞株,制备腹水检测腹水效价,利用免疫胶体金原理将制备的单克隆抗体两两配对,制备CyHV-3免疫检测试纸条。结果显示,通过Dot-blot法、Western-blot法检测,一共筛选出4株效价较高、特异性强的单克隆抗体,分别为1G11株、2C9株、3A6株和3H4株,在细胞免疫荧光中它们均能识别感染CyHV-3的CCB细胞。通过Dot-blot检测腹水效价,其抗体效价分别为1G11株1:40000,2C9株1:160000,3A6株1:80000,3H4株1:40000。初步研制出以3A6抗体标金,2C9抗体划膜的CyHV-3胶体金免疫检测试纸条,能够检测纯化的CyHV-3,,能特异性检测CyHV-3,与CyHV-2无交叉反应,能够检测出稀释20倍的CyHV-3病毒感染液,后续仍然会对试纸条的灵敏度进行进一步的优化。