【摘 要】
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研究目的:1.明确一种DJ-1抑制剂STK793590体外是否对多发性骨髓瘤（MM）细胞的增殖及凋亡产生影响。2.若STK793590存在对MM细胞的抑制效应,进一步探讨其初步机制。3.明确STK793590是否能增加MM细胞对硼替佐米（Bz）的敏感性。研究方法:1.采用不同浓度的STK793590（12.5μM-100μM）及对照组（二甲基亚砜,DMSO）处理RPMI8226细胞,作用不同时间（
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研究目的:1.明确一种DJ-1抑制剂STK793590体外是否对多发性骨髓瘤（MM）细胞的增殖及凋亡产生影响。2.若STK793590存在对MM细胞的抑制效应,进一步探讨其初步机制。3.明确STK793590是否能增加MM细胞对硼替佐米（Bz）的敏感性。研究方法:1.采用不同浓度的STK793590（12.5μM-100μM）及对照组（二甲基亚砜,DMSO）处理RPMI8226细胞,作用不同时间（24h、48h、72h）后,CCK-F法检测细胞增殖情况;Edu细胞增殖分析:STK793590（50μM）处理RPMI8226细胞,48h后镜下观察细胞荧光强度的变化。2.不同浓度 STK793590（25μM、50μM、100μM）及 DMSO 作用RPMI8226细胞48h后,PI孵育,流式细胞术检测RPMI8226细胞周期的分布情况;蛋白免疫印迹（Western-blot,WB）检测细胞周期相关蛋白CDK1、Cdc25c 的变化。3.软琼脂克隆形成实验:STK793590（50μM）及DMSO分别处理RPMI8226细胞,2周后显微镜下观察细胞克隆形成情况。4.不同浓度 STK793590（25μM-100μM）及DMSO 处理 RPMI8226细胞 48h,50μMSTK793590 作用 RPMI8226 细胞不同时间（24h、48h、72h）后,采用Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞的凋亡变化;WB检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达水平的变化。5.初步机制研究:利用装载2,7-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）荧光探针检测不同浓度STK793590及DMSO处理RPMI8226后细胞内活性氧（ROS）的变化情况;WB检测血管生成相关因子成纤维生长因子（bFGF）、血管内皮生长因子-A（VEGF-A）以及PTEN/PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达水平的变化。6.STK793590、Bz单药以及两药联合作用于RPMI8226细胞,采用CCK-F法检测细胞的增殖变化,流式细胞术检测其细胞周期和凋亡的变化。结果:1.STK793590对RPMI8226细胞增殖、周期、克隆形成及凋亡的影响1.1 CCK-F实验结果示:STK793590能够明显抑制RPMI8226细胞的增殖,且随药物浓度的增加及作用时间的延长,抑制效应越明显,呈现明显的时间及浓度依耐性（P＜0.001）;荧光显微镜观察结果示:与DMSO组比较,50μM STK793590处理RPMI8226细胞48h后的荧光强度明显减弱（P=0.0148,P＜0.05）。1.2 STK793590处理RPMI8226细胞后周期阻滞在G2/M期,除25μM STK793590与DMSO组相比差异无统计学意义外,其余均有统计学意义（P＜0.01）;进一步WB检测结果示:随处理浓度升高,RPMI8226细胞的周期蛋白CDK1及Cdc25c表达水平显著降低,表明STK793590能够造成RPMI8226细胞阻滞在G2/M期。1.3软琼脂克隆实验结果示:与DMSO组相比,STK793590处理组中RPMI8226细胞克隆形成能力明显下降。1.4与DMSO组比较,STK793590处理RPMI8226细胞后随着浓度增加及时间延长,细胞总凋亡率增加（P＜0.05,P＜0.01）,促凋亡蛋白Bax表达水平明显增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平明显下降,Bax/Bcl-2比值明显升高。2.初步机制研究2.1利用装载DCFH-DA荧光探针检测STK793590处理RPMI8226细胞后ROS变化,结果示:随STK793590浓度的增加,RPMI8226细胞内ROS水平均未见明显变化。2.2 STK793590处理RPMI8226细胞后,随着药物浓度增加,RPMI8226细胞中bFGF蛋白表达水平明显降低,而VEGF-A蛋白表达水平未见明显差异变化;此外,随着浓度增加,PTEN蛋白表达水平明显增高,且磷酸化蛋白Akt（p-Akt）蛋白表达水平下降,然而总AKT（total-AKT）蛋白表达水平未见明显变化。3.与Bz或STK793590单药相比,Bz联合STK793590处理后细胞的增殖抑制更加明显（P＜0.01）,凋亡细胞的比例明显升高（P＜0.01）。结论:1.STK793590能在体外抑制骨髓瘤RPMI8226细胞增殖,造成细胞周期G2/M期阻滞,并促进细胞凋亡。2.STK793590对RPMI8226细胞的抑制作用可能是通过影响bFGF蛋白表达及PTEN/PI3K/Akt信号通路,但有待进一步实验验证。3.STK793590能协同增强Bz的抗骨髓瘤效应,值得进一步探索其抗肿瘤潜质。
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