燃料乙醇是目前公认的,也是最有发展前景的一种可再生清洁能源。以木质纤维素类生物质为原料生产燃料乙醇,不仅能够降低燃料乙醇在生产原料方面的成本,同时也在环境保护、废弃物处理再利用等方面均起到重要的作用。木质纤维素类原料水解后产生大量单糖,其主要成分为木糖和葡萄糖。可对于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等传统的乙醇发酵工业菌种来说,由于其本身并不具有完善的木糖代谢流,所以无法有效地利用木糖。因此,若想实现有效地利用木质纤维素,通过微生物发酵来生产燃料乙醇,解决菌种问题势在必行。本文酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)TG以及树干毕赤酵母(Pichia stipitis)为出发菌株,进行原生质体融合,并通过发酵及分子手段筛选融合了三株菌株的基因组,具有完整木糖代谢流,且能够高效利用木糖生产乙醇的融合子。在确定了各个原始菌株的原生质体制备及再生的最佳条件的基础上,采用原生质体融合方法,以树干毕赤酵母(Pichia stipitis)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)TG为亲本菌株,选用灭活原生质体的方法做为筛选标记,选取经由不同灭活方式处理的双亲株原生质体进行融合,最终筛选出20株融合株。其中,TP-11以木糖为单碳源发酵时乙醇得率最高,为0.2438g/g,较亲本株之一的树干毕赤酵母(Pichia stipitis)(乙醇得率0.1710 g/g)提高了 20.2%,而另一亲本株TG几乎不能够发酵木糖产乙醇。对融合子的基因组进行PCR验证,证明了木糖还原酶基因xyl1及木糖醇脱氢酶基因xyl2基因已稳定的整合于所得融合子的染色体上;融合子中和木糖代谢相关的木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶酶活的测定结果也表明,在测量48小时结果时TP11的木糖还原酶酶活力达到了 6.5791U/mg,较TG提高了 409%,相比于树干毕赤酵母(Pichia stipitis)提高了 27.8%;TP11木糖脱氢酶的酶活力为16.1712U/mg,较亲本株TG提高了 104%,相对于亲本株树干毕赤酵母(Pichia stipits)提高了 10.4%;TP11的木酮糖激酶酶活力达到了 115.1298U/mg,较亲本株树干毕赤酵母(Pichia stipitis)提高了 17.3%,说明了该3种基因得到了有效表达。本课题研究的成功,为酿酒酵母木糖代谢途径的建立及原生质体融合子筛选方法的优化提供了新的成功实例,为酿酒酵母的木糖代谢工程和木质纤维素的生物转化制取乙醇研究提供有力基础。