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研究背景乳腺癌位居中国女性恶性肿瘤发病率之首,严重威胁着数十万女性的身心健康。据世界卫生组织（World Health Organization,WHO）统计,2018年全球新发乳腺癌病例约有209万,而乳腺癌死亡病例约为63万。乳腺癌全球发病率持续上升,且呈现年轻化的趋势,成为当前社会的重大公共卫生问题。乳腺癌是一种异质性疾病,个体差异明显、发病机制复杂,因此深入研究乳腺癌发生发展的分子机制,对寻找有效的药物靶点,实现肿瘤患者的个体化精准治疗具有十分重要的意义。FAM83D（family with sequence similarity 83,member D,又称 CHICA）是FAM83家族中的一种有丝分裂相关蛋白,在细胞有丝分裂过程尤其是在姐妹染色单体分离、染色体赤道板聚集的过程中起着关键的作用。近期的研究发现FAM83D在肺癌、卵巢癌、结直肠癌等多种肿瘤中高表达,而且这种高表达与多数肿瘤的不良预后密切相关,因此FAM83D被认为是一种重要的癌蛋白,在人类肿瘤的发生发展中发挥重要的作用。我们课题组的前期研究发现FAM83D在人乳腺癌细胞中的表达显著升高,敲低FAM83D可以显著抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移和上皮间质转化（epithelial-mesenchymaltransition,EMT）,提示FAM83D在乳腺癌中同样具备癌蛋白的潜能,其功能过度活化会促进乳腺癌的发生发展。但目前对FAM83D的认识和有关该基因的研究报道非常局限,FAM83D在乳腺癌中的确切作用、作用机制及临床意义有待于进一步深化和阐明。FBXW7属于F-box蛋白家族中的FBXW亚类,是泛素-蛋白酶体系统中E3泛素连接酶SCF复合物的组成成分,在蛋白泛素化降解过程中发挥底物识别的作用。FBXW7蛋白分子中有三个重要的结构域,它们分别是:F-box结构域,通过与SKP1直接结合募集SCF复合体的其他组分;D-domain结构域,FBXW7二聚化结构域,促进FBXW7二聚体形成;WD-40结构域,介导FBXW7与靶蛋白结合。FBXW7降解的靶蛋白多为一些促进肿瘤发生发展的癌蛋白,如:c-Myc、cyclinE、mTOR、Notch、AURKA等。越来越多的研究表明FBXW7是重要的抑癌蛋白,其在肺癌、胃癌、乳腺癌等多种肿瘤中存在突变、表达下调、或功能缺失,但是FBXW7在肿瘤中表达降低或功能性失活的机制尚未完全阐明。我们课题组前期在探讨FAM83D促进乳腺癌的发生发展机制时发现FAM83D可以与FBXW7结合并下调FBXW7的表达,但是FAM83D引起FBXW7下调的具体机制并不清楚。本研究旨在进一步探索FAM83D下调FBXW7表达的作用机制,通过对FAM83D与FBXW7的具体相互作用位点及调控机制的探索,深入理解FAM83D在乳腺癌发生发展中的作用和作用机制,为乳腺癌临床治疗靶点的选择和设计提供思路。研究目的解析FAM83D下调FBXW7表达的作用机制研究方法1.鉴定FAM83D分子中与FBXW7的结合位点（1）构建FAM83D各种截短突变体和点突变体质粒与FBXW7全长共转染HEK293T细胞,通过免疫共沉淀和Western blot技术检测FAM83D各突变体与FBXW7的结合,确定FAM83D分子中与FBXW7结合的具体位点。（2）采用逆转录病毒感染方法构建野生型FAM83D过表达细胞系MCF7-FAM83D、结合位点突变型FAM83D过表达细胞系MCF7-FAM83D-M2及对照细胞系MCF7-Ctrl,经嘌呤霉素筛选后,Western blot技术检测FAM83D的表达。（3）应用上述构建的细胞系,Western blot技术检测FBXW7及其下游靶蛋白的表达,分析FAM83D通过结合位点影响FBXW7的表达及功能。（4）应用上述构建的细胞系,通过MTT及克隆形成实验检测FAM83D通过结合位点影响乳腺癌细胞的增殖能力。（5）应用上述构建的细胞系,通过细胞划痕、Transwell、Matrigel实验检测FAM83D通过结合位点影响乳腺癌细胞的侵袭迁移能力。（6）将上述构建的细胞系分别通过裸鼠皮下种植和尾静脉注射方式建立异种移植瘤和转移瘤模型,监测瘤体形成、生长及转移情况,分析FAM83D通过结合位点影响乳腺癌细胞体内成瘤及转移能力。2.鉴定FBXW7分子中与FAM83D的结合位点构建FBXW7各种截短突变体质粒与FAM83D全长共转染HEK293T细胞,通过免疫共沉淀和Western blot技术检测FBXW7分子各突变体与FAM83D的结合,确定FBXW7分子中与FAM83D结合的具体序列。3.探讨FAM83D下调FBXW7表达的分子机制（1）HA-FBXW7-WT、Flag-FBXW7-WT 分别与 Myc-Vector、野生型 FAM83D（Myc-FAM83D-WT）及结合位点突变型 FAM83D（Flag-FAM83D-M2）共转染HEK293T细胞,免疫共沉淀和Western blot技术检测HA-FBXW7和Flag-FBXW7的相互作用,明确FAM83D对FBXW7二聚化的影响。（2）HA-FBXW7-WT 和 Myc-Ubiquitin 分别与 Flag-Vector、Flag-FAM83D-WT、Flag-FAM83D-M2共转染HEK293T细胞,免疫共沉淀和Western blot技术检测FAM83D对FBXW7泛素化的影响。（3）放线菌酮（cycloheximide,CHX）分别处理上述构建的稳定细胞系细胞0h,3h,6h,9h,12 h,15 h,Western blot技术检测 FAM83D对FBXW7蛋白稳定性的影响。研究结果1.FAM83D 通过 H343/L344 位点与 FBXW7 结合（1）免疫共沉淀和Western blot结果显示:FAM83D截短突变体1-490与FBXW7结合而Flag-FAM83D-1-330与FBXW7不结合,提示结合位点在330-490之间。Flag-FAM83D-1-365 与 FBXW7 结合,Flag-FAM83D-350-615 和 Flag-FAM83D-373-615与FBXW7不结合,使结合位点进一步缩短到330-350之间。Flag-FAM83D-1-335 和 Flag-FAM83D-1-341 与 FBXW7 不结合,说明结合位点在 341-350之间。通过不同物种间FAM83D的氨基酸序列对比发现K340/F341、H343/L344、P349位点氨基酸具有高度保守性,因此构建了 FAM83D M1（K340R/F341Y）、M2（H343R/L344A）、M3（P349A）点突变体质粒。Flag-FAM83D-M1 和 Flag-FAM83D-M3 与 FBXW7 结合,Flag-FAM83D-M2 与 FBXW7不结合,提示H343/L344位点是FAM83D与FBXW7相互作用的关键位点（2）成功构建野生型FAM83D过表达细胞系MCF7-FAM83D、结合位点突变型FAM83D过表达细胞系MCF7-FAM83D-M2及对照细胞系MCF7-Ctrl,经Western blot验证过表达细胞系中FAM83D显著上调。（3）应用Western blot技术检测上述细胞中FBXW7及其下游靶蛋白水平,结果显示:MCF7-FAM83D组较MCF7-Ctrl组FBXW7下调明显,FBXW7靶蛋白水平升高,而MCF7-FAM83D-M2组FBXW7及其靶蛋白水平较MCF7-Ctrl组无明显变化,提示FAM83D通过H343/L344位点下调FBXW7的表达和功能。（4）MTT实验结果显示:MCF7-FAM83D细胞生长速度明显高于MCF7-Ctrl组,H343/L344突变后细胞生长速度与MCF7-Ctrl组无明显差异。克隆形成实验结果显示:MCF7-FAM83D组在克隆形成的大小及数目上均高于MCF7-Ctrl组,H343/L344突变后与Ctrl组无明显差异。结论:FAM83D显著促进乳腺癌细胞增殖,而H343/L344突变后FAM83D促进乳腺癌细胞增殖的能力显著减弱,提示FAM83D通过H343/L344位点发挥作用。（5）细胞划痕结果显示:MCF7-FAM83D组细胞的创伤愈合能力显著高于MCF7-Ctrl组,H343/L344突变后细胞愈合能力与MCF7-Ctrl组无明显差异。Transwell细胞迁移实验结果显示:MCF7-FAM83D细胞穿过BD小室底膜的数量显著多于MCF7-Ctrl组,H343/L344突变后穿过BD小室底膜的细胞数量与Ctrl组无明显差异。Matrigel结果显示:MCF7-FAM83D组细胞穿过基质胶和BD小室底膜的数量显著多于MCF7-Ctrl组,H343/L344突变后穿过基质胶和BD小室底膜的细胞数量与Ctrl组无明显差异。结论:FAM83D显著促进乳腺癌细胞侵袭迁移,而H343/L344突变后FAM83D促进乳腺癌细胞侵袭迁移的能力显著减弱,提示FAM83D通过H343/L344位点发挥作用。（6）裸鼠异种移植瘤模型结果显示:与MCF7-Ctrl组相比MCF7-FAM83D组细胞在裸鼠内形成肿瘤的生长速度及瘤体重量均显著增加,H343/L344突变后细胞在裸鼠内形成肿瘤的生长速度及瘤体重量较MCF7-Ctrl组无明显差别。裸鼠肿瘤远处转移模型结果显示:MCF7-FAM83D组转移灶数目和大小明显高于MCF7-Ctrl组,H343/L344突变后较MCF7-Ctrl组无明显差别。结论:在体内条件下FAM83D显著促进乳腺癌细胞的体内成瘤及侵袭迁移能力,而H343/L344突变后FAM83D促进乳腺癌细胞体内成瘤及侵袭迁移的能力显著减弱,提示FAM83D通过H343/L344位点发挥作用。2.FBXW7分子通过173-231区域与FAM83D结合应用免疫共沉淀和Western blot技术检测FBXW7各截短突变体与FAM83D的相互结合,结果显示:FBXW7截短突变体HA-FBXW7-1-383（N-ΔWD）、HA-FBXW7-1-283（N-ΔF）与FAM83D结合,提示结合位点可能在1-283区域。HA-FBXW7-1-278（αN+D）、HA-FBXW7-231-707（C-D）、HA-FBXW7-326-707（C-ΔF）与FAM83D不结合,结合位点所在区域范围进一步缩短至1-231之间。HA-FBXW7-1-173（αN）与 FAM83D 不结合,提示 FBXW7 的 173-231 区域是与FAM83D相互作用的关键区域。3.FAM83D下调FBXW7表达的作用机制（1）应用免疫共沉淀和Western blot技术检测FAM83D对FBXW7二聚化的影响,结果显示:Myc-FAM83D-WT转染组,与HA-FBXW7-WT共沉淀的Flag-FBXW7-WT相较Myc-Vector转染组显著减少,而H343/L344突变后FAM83D失去了抑制FBXW7二聚化的能力,结论:FAM83D通过H343/L344位点与FBXW7的173-231区域结合抑制了 FBXW7二聚体形成。（2）应用免疫共沉淀和Western blot技术检测FAM83D对FBXW7泛素化的影响,结果显示:Flag-FAM83D-WT转染组FBXW7的泛素化显著高于Flag-Vector转染组,表明FAM83D促进FBXW7泛素化,而H343/L344突变后FAM83D失去了促进FBXW7泛素化的能力,提示FAM83D通过H343/L344位点与FBXW7的173-231区域结合促进了 FBXW7的泛素化。（3）应用Western blot技术检测上述细胞系中FAM83D对FBXW7蛋白稳定性的影响,结果显示:MCF-FAM83D组FBXW7的半衰期较MCF-Ctrl组显著缩短,表明FAM83D促进FBXW7降解,而H343/L344突变后FAM83D失去了促进FBXW7降解的能力,提示FAM83D通过H343/L344位点与FBXW7的173-231区域结合缩短了 FBXW7的半衰期,加速了 FBXW7蛋白的降解。研究结论1.FAM83D分子通过H343/L344位点与FBXW7结合。2.FAM83D通过H343/L344位点下调FBXW7的表达并抑制FBXW7对靶底物的降解。3.FAM83D通过H343/L344位点促进乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。4.FBXW7分子通过173-231区域与FAM83D结合。5.FAM83D通过和FBXW7结合,干扰FBXW7二聚体的形成,进一步促进其泛素化降解,抑制FBXW7的表达和功能。