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多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,PAHs)是一种具有“三致”效应的持久性有机污染物。我国土壤普遍受到了PAHs的污染,给人体健康和生态安全带来了潜在的危害。目前虽然修复PAHs污染土壤的方法不少,但利用酶制剂修复的报道不多。漆酶(laccase)是一种含铜的多酚氧化酶,可以高效转化某些PAHs,并有希望成为一种新型的酶学修复手段,但是目前关于漆酶修复PAHs的机理和应用还缺乏认识。本研究首先在液相中对纯漆酶转化PAHs的种类、最佳反应条件、产物及其毒性进行了研究,然后采用室内模拟实验评估了纯漆酶对PAHs污染土壤的修复潜力,并利用盆栽试验,考察了3株产漆酶的白腐真菌对PAHs污染土壤的修复效果和生态效应,最后从农业废弃物--菇渣中提取得到了漆酶粗酶液,并探讨了该粗酶液对PAHs降解的潜力和机理。
本研究的主要结果总结如下:
1)变色栓菌漆酶可以有效的转化蒽、苯并[a]芘和苯并[a]蒽等3种PAHs,添加介体2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2,2’-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid,ABTS)使变色栓菌漆酶有效的转化了芴。
2)采用单因素实验,系统分析了反应条件对变色栓菌漆酶和血红密孔菌漆酶对蒽或苯并[a]芘转化的影响,发现当在反应体系中添加10%的乙腈、反应pH≈4、反应温度为40℃、反应时间大于24 h时,两种漆酶对蒽或苯并[a]芘具有较高的转化率;介体ABTS可大大提高变色栓菌漆酶和血红密孔菌漆酶对蒽或苯并[a]芘的转化率,这些结果为进一步利用漆酶进行土壤修复奠定了基础。
3)通过GC-MS分析发现,变色栓菌漆酶主要把蒽转化为了9,10-蒽醌,但把苯并[a]芘转化为了3种产物。通过Microtox技术分析发现,蒽和苯并[a]芘及其漆酶的转化产物均无显著的急性毒性,表明采用漆酶处理PAHs不会增加环境中的急性毒性。
4)采用室内模拟实验考察了变色栓菌漆酶和血红密孔菌漆酶对PAHs污染土壤的修复潜力,发现变色栓菌漆酶可有效的转化土壤中的蒽、苯并[a]芘和苯并[a]蒽,ABTS可以促进漆酶对土壤中大多数PAHs的转化,表明漆酶在土壤修复中具有一定的应用前景。
5)通过盆栽试验考察了平菇、4号真菌和杏鲍菇等白腐真菌的菌剂对PAHs污染土壤的修复潜力和生态效应,发现3株白腐真菌均对土壤中PAHs具有一定的降解能力和去毒效果,其中平菇对15种PAHs的总降解率最高,而4号真菌对PAHs污染土壤的去毒率最高;研究还发现白腐真菌改变了土壤中真菌或细菌的数量和群落结构;添加未接种真菌的培养基对土壤中PAHs具有一定的降解能力,其中对蒽、苯并[a]芘和蒽等3种PAHs的降解率最高;真菌-紫花苜蓿联合修复对土壤中PAHs的降解效果劣于单独的真菌修复。
6)分析了菇渣提取液中3种木质素降解酶的活性,发现双孢菇、杏鲍菇、平菇和鸡腿菇的菇渣粗酶液中均含有漆酶,而不含木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶,其中双孢菇粗酶液中漆酶活性最高;双孢菇、杏鲍菇、平菇和鸡腿菇的菇渣粗酶液均能有效降解多达9种的PAHs(蒽、苯并[a]芘、苯并[a]蒽、苊烯、芴、芘、二苯并[a,h]蒽、苯并[g,h,i]芘和茚并[1,2,3-cd]芘)。与纯漆酶相比,菇渣粗酶液对PAHs的降解不仅种类较多,而且降解效率较高,因此菇渣粗酶液在环境修复中具有更大的实用价值;菇渣粗酶液中普遍存在着天然的漆酶介体,这可能导致了其漆酶活性与对PAHs降解率之间的不相关性。杏鲍菇菇渣粗酶液对蒽和苯并[a]芘降解率最高,因此在4种菇渣粗酶液中,杏鲍菇粗酶液是最具潜力的可用于PAHs降解的酶制剂。