【摘 要】
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苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）是目前研究最深、应用最广的一种微生物杀虫剂。Cry系列毒素蛋白（δ-endotoxins）是Bt产生的最重要的毒素蛋白之一,能有效应用于鳞翅目、鞘翅目、双翅目害虫及植物病原线虫的防治。但是,与上述害虫相比较,当前Bt对于既能刺入寄主体内又能吸食其体液的半翅目害虫叶蝉暂还没有强毒杀、效果好的Cry毒素,对此种害虫防治仍主要依赖化学农
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苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）是目前研究最深、应用最广的一种微生物杀虫剂。Cry系列毒素蛋白（δ-endotoxins）是Bt产生的最重要的毒素蛋白之一,能有效应用于鳞翅目、鞘翅目、双翅目害虫及植物病原线虫的防治。但是,与上述害虫相比较,当前Bt对于既能刺入寄主体内又能吸食其体液的半翅目害虫叶蝉暂还没有强毒杀、效果好的Cry毒素,对此种害虫防治仍主要依赖化学农药,鉴于对茶叶生产的重大危害,迫切需要研发针对茶树主要害虫茶假眼小绿叶蝉的新型Cry蛋白。基于以上思路,本研究利用基因技术定向改造Bt Cry毒素分子入手,以期对叶蝉有毒杀作用的新型Cry毒素:（1）通过噬菌体短肽筛选技术获得能和叶蝉中肠上潜在受体相结合的短肽序列,构建短肽-EGFP融合蛋白并进行pull-down,western blot和荧光显微镜观察,从而验证短肽与叶蝉中肠刷状缘膜囊泡（brush border membrane vesicle,BBMV）结合活性。结果显示,5轮噬菌体短肽筛选后成功地获得2条可以和叶蝉BBMV相结合的短肽（RGATPMS,命名为R肽;GYSSFNRG,命名为G肽）,而且该短肽与靶标害虫中肠结合活性较强,从而为后续Cry环区改造提供了良好的替换短肽。（2）通过基因片段替换法将上述筛选的R肽、G肽分别替换Cry1Ab主导受体识别的3个loop,筛选和改造出六株新型Cry毒素:Cry1Ab-1R、Cry1Ab-2R、Cry1Ab-3R、Cry1Ab-1G、Cry1Ab-2G、Cry1Ab-3G。通过配体印迹检测及结构稳定性分析,发现改造后Cry蛋白与叶蝉中肠BBMV潜在受体结合活性较强,三维结构预测无差异,推测Cry1Ab功能表达不受影响。膜饲喂法生物测定验证这些新型蛋白对叶蝉致死速率有不同程度提高。综合以上结果表明,定向改造后的Bt Cry毒素与茶假眼小绿叶蝉中肠BBMV结合活性较强,相应毒杀效应有所增强。这不仅可扩大Bt Cry杀虫谱,对于Bt的进一步推广和应用还具有深远的指导意义。
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