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背景:炎症级联反应在脑缺血再灌注损伤中发挥着重要作用。固有免疫应答是机体重要的防线,同时也是机体获得性免疫应答的基础。核苷酸结合寡聚化结构域受体(nucleotide-binding domain,leucine-rich repeat-containing,NLR)家族是近年来研究的热点,其主要的功能是参与机体的免疫应答反应,在炎症方面发挥重要的作用。The NOD-like receptor pyrin domain containing 6(NLRP6)是NLR家族中的一员,与NLR家族的其他成员一样,NLRP6也可被内源性或者外源性信号激活,从而组成炎症小体(NLRP6、ASC、pro-caspase-1),该炎症小体可剪切pro-caspase-1成为成熟的caspase-1,进一步刺激IL-18和IL-1β的成熟,加速后续的炎症反应,从而加重脑损伤。目前关于NLRP6的研究还处于起步阶段。一方面NLRP6可以依赖炎症小体的形式在牙龈成纤维细胞和急性肝损伤中发挥促炎作用;另一方面,有一些报道也证实NLRP6可以不依赖炎症小体的方式在结肠炎、肠损伤及传染性肠炎等发挥抗炎作用。然而,NLRP6在脑缺血再灌注损伤后的作用尚未见报道。目的:探讨NLRP6对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响,并进一步阐明其是否通过依赖炎症小体的方式发挥促炎作用。方法:(1)根据Longa线栓法,使用SD大鼠建立大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,并随机把实验动物分为6组:假手术组(sham组)、再灌注6h/12h/24h/48h/72h MCAO组。操作过程中,(1)使用4%的水合氯醛,对SD大鼠进行腹腔局部麻醉;(2)模型组均使用线栓插入左侧大脑中动脉1h,用以模拟脑缺血再灌注损伤;(3)收集各组相同部位的大鼠皮层脑组织用于后续的Western blot和RT-qPCR实验。(2)随机分组为6组:模型组(MCAO组)、模型组+control siRNA组、模型组+特异性NLRP6 siRNA(NLRP6 209/864/1439/2519),在造模前对实验动物进行左侧脑室注射,并应用Western blot来筛选有最佳干扰效果的NLRP6的小分子干扰片段。(3)Sham组、模型组、模型组+control siRNA组、模型组+特异性NLRP6 siRNA组进行TTC染色,观察并计算各组脑梗死的体积,评估各组大鼠神经功能缺损情况;测定脑含水量;HE和尼氏染色法评价神经细胞损伤情况,同时采用MPO染色的方法观察中性粒细胞浸润情况。(4)利用免疫印迹实验(Western blot)测定Sham组、模型组、模型组+control siRNA组、模型组+特异性NLRP6 siRNA组的NLRP6及下游相关炎症因子Cleaved-caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白表达水平,并采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定IL-1β和IL-18的酶活性。(5)运用免疫共沉淀(C0-IP)法检测Sham组、模型组、模型组+control siRNA组、模型组+特异性NLRP6 siRNA组的NLRP6与ASC的结合水平。结果:(1)我们的结果显示NLRP6 mRNA的表达高峰出现在脑缺血再灌注损伤后24h,NLRP6的蛋白表达高峰出现在脑缺血再灌注损伤后48h。(2)构建的四条NLRP6 siRNA(NLRP6 209/864/1439/2519)片段中,NLRP6 siRNA 209(sense:5’-CCUCACAGACAAGCUGAUUTT-3’;antisense:5’-AAUCAGCUUGUCUGU-GAGGTT-3’)是干扰效果最佳的小分子RNA,使用NLRP6-rat-209可明显降低大鼠脑组织中NLRP6的蛋白表达水平。(3)与MCAO组相比,MCAO+NLRP6 siRNA组的脑缺血再灌注损伤显著减轻,大鼠行为学缺损也有所改善。(4)与MCAO组相比,MCAO+NLRP6 siRNA组的Cleavedcaspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白表达水平显著下调,同时IL-1β和IL-18的酶活性明显降低。(5)与MCAO组相比,使用特异性siRNA对NLRP6进行干扰可显著降低NLRP6与ASC的结合水平。结论:(1)NLRP6的蛋白表达高峰出现在脑缺血再灌注损伤后48h;NLRP6 siRNA可减轻脑缺血再灌注损伤,并改善神经功能损伤。(2)NLRP6在大鼠脑缺血再灌注损伤后以依赖炎症小体的方式发挥促炎作用。